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亨廷顿氏病等基因少年iPSC模型中的脑微血管内皮细胞功能障碍

摘要

亨廷顿氏病(HD)是一种遗传性神经退行性疾病,由亨廷顿基因中胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)重复序列扩增引起,导致神经元丢失,认知和运动功能下降。越来越多的证据表明血脑屏障(BBB)功能障碍可能导致疾病的进展。动物模型研究在体外模型和死后组织中发现,疾病进展与微血管密度增加、脑血流量改变以及细胞旁和跨细胞屏障功能丧失有关。在这里,我们报告了使用诱导多能干细胞(iPSCs)分化成脑微血管内皮样细胞(iBMECs)的等基因对扩增CAG重复序列导致血脑屏障表型的变化。我们发现,与幼年HD相关的CAG扩增改变了iBMEC分化的轨迹,产生的细胞贴壁内皮细胞的百分比降低了约两倍。CAG扩张与跨内皮电阻降低和紧密连接蛋白表达降低有关,但细胞旁通透性无显著变化。虽然在HD iBMECs中未观察到突变型亨廷顿蛋白(mHTT)聚集,但与iPSCs相比,在iBMECs中观察到广泛的转录失调。此外,CAG在ibmec中的扩张对病理性和治疗性扰动(包括血管生成因子、氧化应激和渗透应激)有不同的反应。在组织工程血脑屏障模型中,ibmec在表型上表现出微妙的变化,包括细胞周转和免疫细胞粘附的差异。我们的研究结果进一步支持了血脑屏障中CAG的扩张有助于HD患者血脑屏障功能障碍。

介绍

亨廷顿氏病(HD)是一种遗传性常染色体显性神经退行性疾病,每10000名美国人中就有1人患病,导致认知缺陷和运动功能丧失,最终导致死亡。1]。HD是由亨廷顿蛋白基因中胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)重复序列的扩增引起的(计画),导致产生突变的亨廷顿蛋白(mHTT)。这种突变导致的转录和蛋白质水平的功能障碍都会导致神经元丧失,并伴有认知和运动功能障碍[2]。

人血脑屏障(BBB)由脑微血管内皮细胞(BMECs)和支持细胞组成,维持神经元稳态。越来越多的体外和体内研究证据表明,HD与血脑屏障功能障碍有关[3.456]。在动物模型和死后人体组织中观察到脑血管变化,包括微血管密度增加[3.78], BBB崩溃[3.4]和脑血流动力学改变[8910]。此外,利用人诱导多能干细胞(iPSC)衍生的bmec样细胞(ibmec)进行的体外研究发现,CAG扩增可提高血管生成潜能,降低细胞旁屏障强度,并改变跨细胞运输[56]。这些脑血管变化可能有助于HD的早期发病机制,并代表一个可能的治疗靶点。然而,BMEC表型的许多方面仍有待探索,迄今为止,等基因对照尚未用于这些研究。为了扩大对BMEC表型变化可能导致HD发病机制的理解,我们基于先前的报告:(1)利用一对等基因iPSCs直接确定CAG突变对分化轨迹和由此产生的iBMEC表型的影响;(2)利用二维(2D)和三维(3D)体外模型在生理线索(即剪切应力)存在的情况下确认结果,并扩大功能测量的范围;(3)通过跨多个分化和协议变量验证我们的结果。

我们从一名具有180个CAG重复序列的青少年HD患者中分化出ibmec,并使用CRISPR/Cas9基因编辑纠正CAG扩增的等基因对照[6]。最近的研究表明,HD的进展与神经发育有关[11],而青少年来源的CRISPR/ cas9校正的ipsc先前被用于显示ipsc来源的神经元表型异常的逆转[12]。我们的方法不同于现有的利用成人HD多能干细胞的工作[5],其中包含年龄引起的表观遗传变化[1314]。我们发现CAG扩张降低了HD ibmec的跨内皮电阻(TEER)(约三倍),与紧密连接蛋白的定位降低相对应,但细胞旁对小分子和大分子化合物的渗透性没有差异。此外,我们证实CAG扩张与不同分化变量(播种密度、Transwell播种密度和培养基组成)的TEER降低有关。关键的是,CAG扩增改变了BMEC表型的其他方面,包括外排活性降低,对血管生成、氧化和渗透因子的敏感性增加,细胞周转失调,免疫细胞粘附增加。

材料与方法

细胞培养

在这项工作中使用了四种诱导多能干细胞(iPSC)来源:具有180 CAG重复序列(HD180)的青少年型HD iPSC [12],具有18个CAG重复序列的HD180的等基因crispr校正对照(hd校正)[12],含有50个CAG重复序列(HD50)的非等基因成人发病HD iPSCs(来自NINDS细胞库#NN0003930),以及含有21个CAG重复序列(HD21)的非等基因对照iPSCs(来自Allen cell Institute #AICS-0023)。这两个等基因细胞由新加坡国立大学的Pouladi实验室提供。每个细胞系的详细信息在附加文件中总结2表S1。细胞培养在37°C和5% CO条件下进行2.使用Searson实验室开发的协议将ibmec与iPSCs进行分化[1516]。简单地说,用Accutase (Invitrogen #A1110501)将iPSC单一化,以10,000细胞厘米的高度在六孔板上播种,形成iPSC集落−2(额外的播种密度如下所述),并在mTeSR™1或TeSR™-E8™(干细胞技术#85850和#05990)中生长3天。请注意,这些媒体不能互换使用。培养板涂有83µg mL−1生长因子还原基底膜基质;康宁#354230)在DMEM/F12 (ThermoFisher 11320033)中在室温下放置1小时。菌落用UM/F-培养基:DMEM/F12、20% KnockOut™血清替代品(ThermoFisher #10828028)、1%非必需氨基酸(ThermoFisher #11140050)、0.5% GlutaMAX™(ThermoFisher #35050061)和0.836 μM β -巯基乙醇(ThermoFisher #21985023)处理6天,然后在内皮培养基中:人内皮细胞无血清培养基(ThermoFisher #11111044)、1%血小板差的人血浆血清(Sigma-Aldrich #P2918), 2 ng mL−1bFGF (Fisher Scientific #233FB025CF)和10 μM全反式维甲酸(Sigma-Aldrich #R2625) 2天。每天切换iPSC培养基,体积为2ml;每天切换UM/F-和内皮细胞培养基,培养基体积为1ml。在分化的各个阶段,基于台盼蓝(康宁#25-900-Cl)排除,在血细胞计上手动计数活细胞。在分化结束时,使用Accutase处理30分钟使细胞单细胞化。在50 μg mL包被的平板上传代分离贴壁细胞−1人胎盘胶原IV (Sigma #C5533)和25 μ mL−1人血浆中的纤维连接蛋白(Sigma #F2006)。该过程在内皮培养基中添加1%青霉素-链霉素(ThermoFisher #15140122)和10 μM ROCK抑制剂Y27632 (ATCC #ACS-3030)进行1小时。传代培养后,用磷酸盐缓冲盐水(PBS;ThermoFisher #10010-023),然后使用Accutase进行10分钟处理。然后将细胞以0.33 × 10的剂量接种于IV型胶原和纤维连接蛋白包被的表面6细胞厘米−2.在培养的前24小时,培养基与传代培养基相匹配,然后用基础培养基(人内皮细胞无血清培养基,1%人血小板差血浆源性血清,1%青霉素-链霉素)代替。使用PowerPlex®18D系统(Promega)确认HD180和hd校正的iPSCs是等基因的。使用基于发光的MycoAlert™支原体检测试剂盒(Lonza #LT07-418)确认不存在支原体。

微分变量

除上述分化方案外,还调整分化变量以确定对结果和iBMEC表型的影响。这些变量包括:(1)初始iPSC播种密度,(2)Transwell播种密度,(3)播种实验前去除继代培养步骤,(4)分化过程中使用的培养基体积,(5)分化和Transwell培养过程中使用无血清培养基替代。为了测试初始播种密度对分化结果的影响,采用上述技术对hiPSCs进行传代,但播种密度分别为5、10、20、30、40 × 103.细胞厘米−2在涂有基质的板上平行。为了测试Transwell播种密度对iBMECs屏障功能的影响,采用上述技术收获细胞,并以0.33和1 × 10的密度在Transwell上播种6细胞厘米−2(密度差三倍)不使用传代纯化步骤。为了确定分化过程中使用的培养基体积的影响,在分化过程中,细胞在1或2 mL的UM/F-和RA培养基中生长。为了确定进行无血清分化的效果,在分化的最后2天和Transwell培养期间,内皮培养基中1%的人血小板不良血浆衍生血清被替换为1 × B-27补充剂(ThermoFisher #17504044),如前所述[17]。

免疫荧光

以250000细胞/ cm的速度接种ibmec−2在硼硅酸盐覆盖玻片上(如上所述涂有纤维连接蛋白和胶原IV),用上述培养基培养2天。然后用1 × PBS洗涤ibmec,用冰甲醇固定15分钟,用10%山羊血清(Cell Signaling Technology #5425)或10%驴血清(Millipore Sigma #D9663)在PBS中添加0.3% Triton X-100 (Millipore Sigma #108643)阻断30分钟。一抗总结在附加文件中2表S2。细胞用Alexa Flour-647和Alexa Flour-488结合的二抗(Life Technologies)在阻断缓冲液中稀释1:200,室温下处理45分钟。用1 μg mL处理细胞,使细胞核定位−1DAPI (ThermoFisher #D1306)。在染色方案的每个步骤之间,单层膜用1XPBS洗涤三次,洗涤5分钟。在倒置显微镜(Nikon Eclipse Ti-E)上使用40倍放大镜(尼康)获得图像,由MLC400单片激光组合器(Keysight Technologies)提供照明。为了实现蛋白质水平的半定量分析,我们将荧光信号归一化为核信号,每个细胞源至少有四个生物重复。

RNA序列

分析了HD180 iPSCs、HD180 ibmec、hd校正iPSCs和hd校正ibmec的两个生物重复。鉴于最近的RNA测序指南建议至少进行三次重复[18,一个限制是我们的分析可能不够有力。诱导多能干细胞在UM/F-培养基中分化前收获,而ibmec在IV型胶原和纤维连接蛋白包被的组织培养板上传代培养2天后作为融合单层收获。为了获得总RNA,使用添加β-巯基乙醇的RLT缓冲液裂解细胞,然后使用带有DNase I酶切的RNeasy Mini Kit (Qiagen #79254)分离RNA。通过Agilent 2100生物分析仪测量,所有测序样品的RNA完整性值均在9.7以上。对总RNA进行寡核苷酸(dT)捕获和富集,得到的mRNA片段用于构建cDNA文库。使用Illumina NovoSeq(由Novogene执行)收集每个样本约2000万对末端150 bp reads。对参考基因组(GRCh38)进行比对和定量Rsubread(v2.0.1) [19]。转录本丰度以每千个碱基的转录本片段数(FPKM)表示。归一化(rlog转换)、可视化和差异分析使用DESeq2(v1.28.1) [20.]。差异表达基因(DEGs)的测定采用Wald检验,benjamin - hochberg校正(调整后)p< 0.05为有统计学意义)。使用enrichment对deg进行途径富集分析(Hallmark基因集和GO生物过程术语),并在调整p值截止值为0.05的情况下使用内置统计分析[21]。RNA-seq数据已存入GEO,登录号为GSE194416。

势垒函数测量

跨内皮电阻;Ω厘米2)记录(World Precision Instruments #EVOM2),如先前报道[16]。测量在6.5 mm Transwells上进行,带有0.4 μm孔径的聚酯膜插入物(康宁#CLS3470)。对TEER值进行校正,以确定没有细胞的Transwell插入物的电阻。播种密度为0.33 ~ 1.00 × 106厘米−2如前所述,在内皮介质中的transwell上。24 h后,将培养基切换为基础培养基,连续10天收集每日记录,不进行额外的培养基切换。为了减少温度依赖性,从培养箱中取出后1分钟内记录TEER值,在不同的实验条件下交替测量。

在第2天,使用先前报道的方案测量了200 μM路西弗黄(ThermoFisher #L453)、2 μM alexafluor647偶联的10 kDa葡聚糖(ThermoFisher #D22914)、10 μM罗丹明123 (ThermoFisher #R302)和25 mM d -葡萄糖(Sigma #G8270)在BMEC单层中的通透性。16]。第10天还进行了一组渗透率实验。在Synergy™H4微孔板阅读器(Biotek)上使用以下激发和发射设置:Lucifer yellow (428 nm/545 nm), 10 kDa dextran (647 nm/667 nm), rhodamine 123 (495 nm/525 nm)。使用比色检测试剂盒(ThermoFisher #EIAGLUC)按照制造商的方案定量葡萄糖转运,并在560 nm处进行吸光度测量。根据每个化合物跨越四个数量级的连续稀释度,从校准曲线确定浓度。各化合物的表观渗透率计算为P=(dC / dt) (V) (1 /) (1 / C0,在那里dC / dt为累积浓度斜率,V为接收室(即基底外侧室或根尖室)的容积;一个单层的面积是多少C0为溶质的剂量浓度[22]。对于罗丹明123,外排比率计算为基底外侧与根尖和根尖与基底外侧渗透率的比值,归一化为10 kDa葡聚糖(一种非外排底物)。为了确保测量不受多孔膜运输的限制,我们证实了Lucifer黄和葡萄糖的渗透性值比没有细胞的Transwells的渗透性低十倍以上。渗透率测量的生物重复在至少两个transwell上进行平均(技术重复)。

对化学扰动的反应

如先前报道的那样,进行了头部血管生成试验[23]。简单地说,将直径150 μm的Cytodex™3微载体珠(Sigma #C3275)包被IV型胶原蛋白和纤维连接蛋白,然后在内皮培养基中添加1%青霉素-链霉素和10 μm ROCK抑制剂。80分钟后,每20分钟轻轻搅拌一次,将1ml新鲜培养基缓慢移液到沉淀的珠上,洗涤珠以去除非贴壁细胞,然后在摇床上以100 rpm的转速培养24小时。然后,将珠包埋在6mg mL中−1中和大鼠尾I型胶原蛋白(康宁#354249),用含或不含50 ng mL的基础培养基处理−1重组人VEGF-165 (VEGF;Biolegend # 583704)。培养3 d后,芽密度(#头−1)从每个条件下至少8个珠(技术重复)的相对比图像中手动计数。

在氧化和渗透胁迫实验中,ibmec如前所述被播种到Transwells上,并暴露于过氧化氢(H2O2;(Sigma #H1109)或甘露醇(Sigma #M4125), 48h后,为避免介质切换,5 μL的浓缩h2O2将新鲜配制的无菌水加入Transwells的顶室中,通过移液轻轻混合至最终浓度为0.2至1mm。暴露后每天记录TEER,不进行介质切换。由于甘露醇在其浓度极限附近诱导血脑屏障打开,将培养基改为含有1.4 M甘露醇的基础培养基,静置10 min后再切换为基础培养基。分别在治疗前、治疗后、1 h后和1 d后记录TEER。为了观察活性氧和肌动蛋白细胞骨架,一些Transwells在0.6 mM H下暴露1天后,用50 μM CellROX®Green Reagent (Invitrogen #C10444), AlexaFluor647 phalloidin (ThermoFisher #A22287)和DAPI溶液在37°C下处理30分钟2O2

组织工程血脑屏障微血管

组织工程血脑屏障微血管的制备如先前报道[24]。将ibmec传代培养1 h后,用Accutase分离,然后播种到直径为150 μm的7 mg mL通道中−1I型胶原蛋白在播种之前,将胶原基质与20 mM genipin (Wako #078-03021)交联以增加硬度,然后在通道表面涂覆胶原IV和纤维连接蛋白以促进细胞粘附。将细胞植入微血管,无流量培养30min,以促进细胞粘附,然后以~ 1 dyne cm灌注微血管−2实验剩余部分的剪切应力。融合单层形成后,微血管灌注200 μM路西法黄1小时,每2分钟采集一次图像。渗透率根据荧光随时间的变化计算,如先前报道的[25]。微血管成像使用10倍物镜(尼康),由X-Cite 120LED-Boost (Excelitas Technologies)提供的荧光照明。通过与荧光图像同时获取的相衬图像计算微血管中iBMECs的周转率。如前所述,在微血管的上平面人工计数细胞损失和细胞增殖事件[24]。从细胞损失和增殖事件的计数中,将值归一化为成像平面内细胞总数和时间,单位为% h−1.净微血管周转率计算为增殖率和损失率之差(% h)−1)。

THP-1 (ATCC®TIB-202™)是一种人类白血病单核细胞系[26]。THP-1在含有10%胎牛血清(Sigma #F4135)和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基(ThermoFisher #11875093)中悬浮生长。使用前,细胞用5 μM Calcein AM (ThermoFisher #C3100MP)标记15分钟,然后以1 × 10重悬6细胞毫升−1在基生介质中。在低剪应力(~ 0.2 dyne cm)下灌注THP-1−2),然后用更高的剪应力(~ 2 dyne cm)冲洗−2)。用荧光显微镜人工计数黏附的免疫细胞。

统计分析

使用Prism ver进行统计分析。8 (GraphPad),指标以平均值±SEM(平均值的标准误差)表示。两组比较采用学生非配对t检验(双尾方差不等)。采用双向方差分析及相互作用分析和Bonferroni多重比较检验比较血管生成反应。生物重复的数量在图例中报告。差异被认为具有统计学意义p< 0.05,阈值* * * p < 0.05, p < 0.01, * * * p < 0.001。

结果

CAG重复序列升高的hipsc显示出独特的BMEC分化轨迹

脑微血管内皮样细胞(iBMECs)从具有180 (HD180)和18 (hd校正)CAG重复序列的等基因iPSCs中分化出来计画基因。分化通过mTeSR1连续治疗3天,UM/F-连续治疗6天,内皮介质(RA)连续治疗2天进行,如先前报道[1516(图。1A).接下来,细胞通过传代培养纯化到IV型胶原蛋白和纤维连接蛋白包被板上,然后分离到玻璃、Transwells或组织工程微血管上播种。与等基因hd校正的iPSCs和其他对照iPSCs相比,HD180 iPSCs的分化明显独特;虽然HD180 iPSC菌落看起来相似,但UM/F-处理导致神经束受限,这是iBMEC分化的标志(红色点线;无花果。1此外,在继代培养后选择性地纯化ibmec,与等基因对照相比,HD180 iPSCs分化产生的贴壁细胞明显减少(图2)。1C)。分化过程中的细胞计数显示,在mTeSR1中3天后HD180 iPSCs的密度更高(p= 0.005)。1D)。相比之下,在分化和传代培养后,我们观察到高密度的hd校正细胞(p两个比较均< 0.001)(图2)。1D)。此外,HD180 iPSC分化的贴壁分数(定义为继代培养后贴壁细胞数除以分化细胞数)较低(p= 0.038)。1E).这些结果表明具有扩增CAG重复序列的iPSCs具有独特的分化轨迹。然而,来自两种iPSC来源的贴壁细胞对血小板内皮细胞粘附分子(CD31)和葡萄糖转运蛋白1 (GLUT-1)表现出一致的免疫反应性。1F)。此外,在两种分化中,多能性标记的基因表达都有所减少(POU5F1SOX2MYC)和ve -钙粘蛋白基因表达的增加(CDH5), glut-1 (SLC2A1)和视黄酸受体(RARA)(图。1G、附加文件2图S1A)。CD31、VE-cadherin和GLUT-1表达被用来评估分化效率[527),而RARA先前已证明上调可诱导iBMEC分化后的屏障功能[28]。总之,这些结果表明,独立于CAG扩增,分化产生脑内皮样细胞。

图1
图1

对比HD-corrected和HD180 iPSCs的分化,揭示了一种独特的iBMEC分化轨迹。一个分化时间线示意图。对hiPSC菌落进行计数,并以10000个细胞厘米传代−2在矩阵涂层板上。ibmec在8天内分化(用UM/F培养基治疗6天,用RA培养基治疗2天)。Bhd校正和HD180 iPSCs在第0、6和8天分化的代表性相衬图像。尽管两种iPSC之间的iPSC集落密度和外观相同,但仅在hd校正的iBMEC分化期间形成神经束周围的内皮集落(红色虚线)。C传代培养hd校正细胞和HD180分化细胞后的代表性相衬图像突出了贴壁细胞比例的差异。D第0天的细胞密度(hiPSCs在10,000 cm处过3天后)−2),第8天(分化细胞),传代后(纯化的iBMECs)。收集的数据n每个细胞系分别有7和8个独立的分化。Ehd校正和HD180 iBMEC的贴壁分数(贴壁细胞与分化细胞的比例)。收集的数据n每个细胞系分别有4和5个独立的分化。Fhd校正和HD180 ibmec的CD31和GLUT-1的代表性免疫荧光图像。GiBMEC分化下调多能性相关基因(POU5F1SOX2MYC),并且上调与内皮和BMEC表型相关的基因(CDH5SLC2A1RARA)。数据表示转化的大体积RNA测序数据的行z分数n= 2个hd校正细胞和HD180细胞的独立分化。转录本丰度(FPKM值)显示在附加文件中2图S1A

CAG膨胀改变势垒功能

我们通过BMEC标记物的免疫荧光成像和跨内皮电阻(TEER)和渗透性的功能测量来表征iBMEC单层(图2)。2)。与hd校正的ibmec相比,HD180单层ibmec显示出相似的claudin-5和VE-cadherin染色,occludin和ZO1的染色减少,P-gp的染色略有增加(图1)。2A)。我们对归一化到核信号的荧光强度进行了半定量分析,发现只有ZO-1在HD180 iBMECs中显著降低(p= 0.040)。2B)。在HD180 ibmec中,ZO-1信号很少定位于连接,在细胞核中有大量信号(图2)。2A-inset)。

图2
图2

HD180 ibmec表现出蛋白质定位和基因表达的改变BBB功能。一个BMEC蛋白(claudin-5, VE-cadherin, ZO1, occludin, ZO1, p -糖蛋白)的免疫荧光检测。ibmec的代表性图像显示在播种后2天。插图显示HD180 ibmec在高倍镜下ZO-1的错误定位。B分化后第2天iBMEC蛋白表达的半定量分析。将荧光信号归一化为核DAPI信号,然后绘制相对于hd校正的图像。收集的数据n= 4-6个独立微分。CDTEER时间过程和平均超过10天。收集的数据n= 16个(hd校正)和26个(HD180)独立鉴别。EF路西法黄和10 kDa葡聚糖通透性(第2天和第10天)。收集的数据n= 6个(hd校正)和8个(HD180)独立鉴别。G罗丹明123外排比(第2天)n= 4-5个hd校正和HD180 ibmec的独立鉴别。H葡萄糖通透性(第2天)n= 4个hd校正和HD180 ibmec的独立鉴别。所有的录音C- - - - - -G表示整个的平均值n=每个生物复制2-6个技术重复(单个Transwells)

hd校正后的细胞呈现典型的TEER时间过程[15],峰值为~ 3000 Ω cm2第二天逐渐减少。HD180细胞表现出独特的轨迹,第2天TEER降低了约3倍(p< 0.001)。hd180和hd校正的ibmec的TEER值均> 1000 Ω cm2第6-10天(图2)2C). 10天的平均TEER为~ 1024 Ω cm2~ 2067 Ω cm2分别适用于hd180和hd校正的ibmec (p< 0.001)。2D)。尽管TEER不同,但Transwells中Lucifer黄(444 Da)的渗透率与CAG在第2天的扩张无关(p= 0.171)和第10天(p= 0.606)。2E),表明尽管CAG扩张,细胞旁通透性仍保持不变。

10 kDa右旋糖酐的渗透性测量结果与路西法黄的观察结果相匹配。2F).路西法黄渗透率为~ 2 × 106厘米的年代−1在第二天和~ 4 × 106厘米的年代−110 kDa葡聚糖的通透性为~ 6 × 108厘米的年代−1第2天和第10天。这些值与以前在其他iPSC源上的iBMEC渗透率测量值相匹配[16]。我们还测量了罗丹明123 (R123) (P-gp外排泵的一种底物)的外排比(根尖到基底外侧的渗透率与基底外侧到根尖的渗透率之比)。与hd校正细胞相比,HD180 ibmec对R123的外排比较低(p= 0.005)。2G)。虽然统计上不显著(p= 0.125), HD180 iBMECs的R123的根尖至基底侧渗透率是前者的约3倍;这些结果表明,外排比的降低可能是由于不适当的极化和活性的降低,这可以通过P-gp抑制进一步探讨。hd校正的ibmec和HD180 ibmec表现出相似的葡萄糖通透性(p= 0.970)。2H)。

我们在第10天对免疫荧光图像进行了进一步的分析,发现在hd校正的ibmec和HD180 ibmec之间cludin -5和VE-cadherin的表达相似(附加文件)2:图S2)。然而,与第2天相比,VE-cadherin信号在第10天特别减弱,表明在延长培养期间内皮表型丧失。因此,在第2天进行后续的功能检测,这对应于ibmec显示峰值TEER值和局部粘附和紧密连接。此外,我们没有观察到与CAG扩增无关的ibmec中突变体HTT的聚集:mEM48荧光信号在两种细胞源中同样可以忽略不计(p= 0.857)(附加文件2:图S2A, B)。

势垒函数的变化与微分变量无关

iBMEC分化对试剂来源、播种密度和血清数量等变量敏感[172930.]。因此,我们试图确定分化变量是否会改变HD-corrected和HD180 ibmec之间的表型差异。我们测试了iPSC播种密度、Transwell播种密度、培养基体积和使用无血清替代品的影响。

在5000、10000、20000、30000和40000细胞厘米处播种iPSCs后−2我们计算了mtesr1、ra和传代培养后的活细胞数(图2)。1A)。在mTeSR1中孵育后(在开始iBMEC分化之前),HD180和hd校正的细胞在高初始播种密度(> 10,000个细胞厘米)下显示出相似的iPSC细胞计数−2),而HD180多能干细胞在较低的播种密度下数量较多(1万格厘米−2) (p< 0.01)(附加文件2:图S3A)。分化后,无论初始播种密度(p< 0.01)(附加文件2:图S3B, C)。在较低的初始播种密度(5000和10,000细胞cm)下,贴壁分数最大−2),但HD180细胞的贴壁率明显较低(p< 0.05)(附加文件2:图S3D)。

在所有初始播种密度和两种细胞源中,我们直接以0.33 × 10的剂量播种Transwells61.0 × 106细胞厘米−2.此外,我们在播种0.33 × 10的Transwells之前进行了传代纯化6细胞厘米−2.在初始播种密度为10,000个细胞cm时,不同播种方式的TEER差异具有统计学意义−2p< 0.05)(附加文件2:图S4)。我们还研究了在分化过程中增加培养基容量和使用血清替代品B-27的效果(附加文件)2:图5)。我们发现在2 mL培养基中进行分化可显著降低HD180的平均TEER (p= 0.013),但hd校正细胞(p= 0.247)。有趣的是,与之前的报道相反,使用无血清分化降低了平均TEER [17];HD180细胞的平均TEER显著降低(p= 0.021),但hd校正细胞(p= 0.352)。

非等基因HD ibmec也维持细胞旁屏障

在健康的个体中计画基因CAG重复长度为20 [31]。为了比较更广泛CAG重复长度范围内iBMEC表型的变化,我们测试了另外两种非等基因iPSC的屏障功能:(1)具有50个CAG重复序列的成人发病HD iPSC系(HD50)和(2)具有21个CAG重复序列的对照iPSC系(HD21)(附加文件)2:表1)。根据HD180和hd校正iPSCs的优化方案(即初始播种密度为10,000细胞cm)进行分化−2,传代纯化细胞,以0.33 × 10的倍率在Transwells上播种6细胞厘米−2)。在所有iPSCs中,粘附ibmec的比例依赖于cag长度(附加文件)2图S6A)。同样,CAG长度越短(18和21),TEER值越高,尽管没有统计学意义(附加文件)2图S6B)。尽管在HD ibmec中观察到TEER普遍降低,但我们的研究结果表明,HD ibmec中维持了细胞旁屏障功能,因为在相似的CAG重复长度下,TEER值仍然高于先前报道的值[5]。

CAG扩增能独特地改变HD ibmec的基因表达

亨廷顿氏病导致大脑中广泛的转录失调[323334]。利用大体积RNA测序来比较HD180和hd校正的iPSCs以及相应的HD180和hd校正的ibmec之间的整体基因表达谱(图2)。3.)。主成分分析(PCA)显示,不同的基因表达谱主要出现在iBMEC分化后(图2)。3.不到5%的上调和下调基因在iPSCs和ibmec之间共享,这表明CAG扩增对两种细胞类型有明显的影响(图2)。3.B)。

图3
图3

HD180 ibmec具有独特的基因表达谱。一个大量RNA测序的主成分分析。收集的数据n=每个细胞系2个独立分化,其中iPSC和iBMEC RNA配对。B维恩图显示ibmec与iPSCs中CAG扩增依赖基因的上调和下调重叠。C火山图比较HD180(蓝色)和hd校正(红色)来源的iPSC和ibmec的基因表达。选择的上调和下调基因被标记。D与hd校正的ibmec相比,HD180中显著富集(蓝色)或缺失(红色)的来自分子特征数据库(MSigDB)的Hallmark基因集。用-log截断基因集的显著性10(形容词)> 5;EHD180 ibmec和hd校正ibmec之间内皮、上皮或GO期转录物变化的热图

我们在HD180和hd校正的iPSCs之间发现了177个上调基因和95个下调基因;然而,使用来自分子特征数据库(MSigDB)的标记基因集进行基因集富集分析(GSEA)发现,只有一个基因集显著富集(上皮间充质转化;在HD180 iPSCs中富集)。3.相比之下,我们在HD180和hd校正的ibmec之间发现了1397个上调基因和982个下调基因,对应于HD180 ibmec中18个富集和10个缺失的标志基因集(图2)。3.HD180 iBMECs富集的标志基因集包括那些参与细胞生长和分裂(G2-M检查点,有丝分裂纺锤体),缺氧,免疫反应(IL-2/STAT5信号,干扰素γ反应)和血管生成的基因集,而缺失的标志基因集包括那些参与典型脑内皮功能的基因集,包括凝血,根尖连接,Wnt/ β -catenin信号,肿瘤坏死因子(TNF)-α信号和补体(图2)。3.D)。显著差异表达的基因,包括驱动标记基因集富集的基因在图中标注。3.C,包括IL4R, CCR1SLC22A2NOS1趋化因子受体CXCR4IL17RDEGR1ZNF208LY6EZNF680FLT1TUNAR,PCDHB5在HD180 ibmec中,和FASBMP1MMP9COL1A1JAG2SERPINF1SCUBE1,IGFBP6在hd校正的ibmec中。额外的文件1有完整的结果转录丰度跨实验组和差异基因表达分析。

我们探索了与典型血脑屏障转录本、上皮转录本和富集氧化石墨烯相关的特定基因集(图2)。3.E)。典型BBB基因在HD-corrected和HD180 ibmec中表达无差异(图2)。3.E、附加文件2:图S1B),与免疫荧光研究中观察到的错定位紧密连接蛋白形成对比。最近的研究表明,ibmec具有上皮特征[35]。我们发现HD180和hd校正的iPSCs的iBMEC分化与一些上皮标记物的上调有关2然而,hd校正的ibmec和HD180 ibmec都显示出相似的上皮转录物丰度(图S1A)。3.E)。这至关重要地表明,上皮身份的差异不会驱动HD-corrected和HD180 ibmec之间的表型差异。HD180 ibmec中最富集的GO项为l-精氨酸跨膜运输(GO:1903400),而hd校正的ibmec中最富集的GO项是通过质膜粘附分子的细胞-细胞粘附(GO:0098742)。相应的转录本高度差异表达(图2)。3.E),并且可能表明由于ibmec中CAG重复数的增加,l -精氨酸运输增加和细胞-细胞粘附受损。

对氧化、血管生成和渗透刺激的反应性

考虑到与HD疾病进展相关的许多细胞过程的转录失调,我们试图确定HD ibmec如何对病理性扰动做出反应。为此,我们评估了HD180 ibmec对氧化、血管生成和渗透应激的反应(图2)。4A). HD患者和无症状HD基因携带者外周血中氧化应激标志物升高[363738]。先前的研究发现,ipsc衍生的小胶质细胞和神经元含有扩增的CAG重复序列,释放高水平的ROS,并对外源应激敏感[3940]。我们评估了氧化应激对暴露于一系列H的ibmec的影响2O2浓度(0.2-1 mM) [41]。H2O2可以对BMEC表型产生浓度依赖性,包括诱导细胞凋亡或血管生成[2342]。在H处,TEER值急剧下降2O2HD-corrected和HD180 ibmec的浓度均大于0.6 mM。4B).该浓度在吸入或摄入后可观察到病理影响的范围内[43]。暴露于0.6 mM H后2O2处理24 h, HD180 ibmec与对照(~ 150 Ω cm)相比,TEER显著降低2) (p= 0.008)。4相比之下,0.6 mM H与0.6 mM H之间的TEER无统计学差异2O2和用于hd校正的ibmec (p= 0.095)(图。4C).暴露于0.6 mM H的HD180 ibmec染色2O2显示了单层中的间隙,而hd校正后的单层保持完整(图2)。4D)。

图4
图4

HD180 iBMECs对氧化、血管生成和渗透应激表现出独特的反应。一个疾病和治疗相关的HD血脑屏障扰动示意图。B- - - - - -DHD180 ibmec更容易受到氧化损伤:B不同H值对iBMEC TEER响应的时间过程2O2浓度。红框表示在细胞源之间产生最独特反应的浓度。C暴露于0.6 mM h后24 h的iBMEC TEER2O2.收集的数据n= 7个(HD180)和6个(hd校正)独立鉴别。D暴露于0.6 mM后24小时细胞活性氧、细胞核和f-肌动蛋白(Phalloidin)的代表性荧光图像。红色箭头表示内皮孔。EVEGFR2的代表性免疫荧光图像。收集的数据n= 6个(HD180)和4个(hd校正)独立鉴别。定量显示在附加文件中2图S2C。F头血管生成试验。用ibmec包被的珠粒,在6 mg mL胶原I +基质中播种,然后添加基础培养基或20 ng mL−1bFGF和50 ng mL−1VEGF。代表性图像显示治疗72小时后的珠子,红色星号表示血管新生芽。G芽密度的定量跨头血管生成试验条件。收集的数据n= 4个(HD180)和3个(hd校正)独立鉴别。H渗透处理(暴露于1.4 M甘露醇10分钟)后TEER的变化。收集的数据n= 5个独立微分

死后HD组织的特征是血管生成微血管的增加[3.4],而HD小鼠模型中观察到星形细胞VEGF-A分泌增加(R6/2) [8]。从HD-iBMEC单层的体外伤口愈合试验中也推断出血管生成表型增加[5]。为了测试血管生成潜力,我们通过在150 μm直径的微珠上涂覆iBMECs进行了微珠血管生成试验。23]。形成融合的单层后,将微珠包埋于I型胶原和基质中,然后暴露于50 ng mL−1血管内皮生长因子。与hd校正细胞相比,HD180 ibmec显示VEGFR2蛋白表达升高约2倍(p= 0.049)(图。4E、附加文件2:图S2C);在转录水平上也观察到类似的倍数差异(KDR),但无统计学意义。VEGF治疗后HD180 ibmec细胞芽密度增加(p= 0.003),但对于hd校正的ibmec (p= 0.999)。4F, G)。我们还测量了所有显示可见芽的成像珠的百分比的相对血管生成活性;VEGF治疗HD180 ibmec后,血管生成珠的百分比增加(p= 0.023),但hd校正的ibmec没有变化(p= 0.280)。这些结果表明,对于短时间的VEGF暴露(72小时),HD180 ibmec表现出独特的血管生成反应。

虽然最近的HD治疗方法利用鞘内给药绕过血脑屏障,但血脑屏障开放(BBBO)代表了一种可能的策略,可以在静脉给药后增加药物给药到神经元。渗透性BBBO利用动脉内输注高渗透性药物来短暂地破坏细胞-细胞连接,从而使大分子质量化合物进入大脑[4445]。我们假设HD ibmec可能对渗透胁迫有独特的反应,鉴于最近的一份报告,AD ibmec (PSEN1突变)表现出对聚焦超声(FUS)的反应性改变,这是治疗短暂性BBBO的另一种策略[46]。为了测试渗透应激反应,我们用临床浓度的高渗剂甘露醇(1.4 M)处理iBMEC单层,用于渗透BBBO, 10分钟。HD180 iBMEC在甘露醇治疗后立即显示出较低的TEER值(p= 0.011), 1小时后(p= 0.029)。考虑到HD ibmec(甘露醇前)最初较低的TEER值,我们的研究结果表明,在渗透胁迫下,细胞旁屏障进一步减弱。考虑到我们之前的研究发现TEER与250 Ω cm以下的渗透率呈反比关系,这种TEER差异预计会导致HD180 ibmec的Lucifer黄渗透率降低216]。

组织工程HD血脑屏障微血管

为了实时研究屏障功能和内皮细胞更新,我们生成了三维组织工程微血管,如先前报道(图2)。5) (24]。组织工程模型概括了人类脑血管系统中存在的许多微环境线索(即剪切应力和细胞- ecm相互作用)[47]。与Transwells的结果相似,我们发现HD180微血管中Lucifer黄的渗透率与hd校正微血管中的渗透率相同(p= 0.691)。5B, C)。然而,与2D Transwell测量结果相比,3D微血管中的Lucifer黄色渗透率降低了约10倍,正如之前使用不同的iPSC源所指出的那样。16]。为了评估HD180或hd校正的ibmec在血脑屏障微血管中的内皮细胞动力学,通过渗透率测量期间获得的延时相位对比成像跟踪了增殖率和细胞损失率(图2)。5D)。HD180微血管的增殖率降低了约2倍(p= 0.042)和细胞损失(p= 0.026),与hd校正细胞形成的微血管相比。这些结果表明HD180微血管显示出独特的内皮细胞更新动力学。此外,基于GSEA改变的先天免疫反应的发现,我们测量了iBMEC微血管中单核细胞样细胞(THP-1 s)的粘附。我们发现,与hd校正细胞形成的微血管相比,HD180微血管显示出更高的免疫细胞粘附性(p= 0.033)(图。5E)。尽管缺乏外部炎症刺激(如TNF-α),但粘连增加了约3倍,这表明HD180 ibmec表现出激活的先天免疫反应。有趣的是,ICAM-1和VCAM-1这两个白细胞运输的关键表面粘附分子的转录物丰度和免疫荧光强度在2D中hd校正和HD180 ibmec之间相似(附加文件)2:无花果。印地S2C)。因此,thp -1在HD180 ibmec上的粘附增加可能是由基因/蛋白表达的其他差异介导的,或者依赖于3D微环境(其中基因/蛋白表达不同)[48])。

图5
图5

组织工程血脑屏障微血管模型,包括HD180或hd校正的ibmec。一个用iBMECs种子制备三维微血管的示意图(左)前视图,(右)侧视图。B带有hd校正和HD180 ibmec的微血管同样限制了路西法黄的运输。有代表性的图像显示。C三维微血管的路西法黄渗透性。收集的数据n= 5个(hd校正)和4个(HD180 ibmec)独立分化。D微血管周转率。收集的数据n= 5个(hd校正)和4个(HD180 ibmec)独立分化。EF单核细胞样细胞与组织工程微血管的黏附:E收集的数据n= 4个(hd校正)和3个(HD180)独立分化的iBMECs植入微血管。F冲洗后贴壁细胞的代表性图像。THP-1荧光过饱和以辅助可视化

讨论

BMEC表型变化总结

比较HD180和hd校正的iBMECs(使用优化的分化方案)揭示了以下关键结果:(1)TEER降低,但渗透性没有差异;(2)外排活性降低;(3)转录失调;(4)内皮细胞损失和增殖减少;(5)对氧化和渗透应激的独特反应;(6)对VEGF的反应增加(和表达升高)VEGFR2(7)增强免疫细胞粘附。对于其中的一些发现,我们发现了基因和蛋白质表达之间的差异。例如,虽然紧密连接转录本类似地表达,但HD180 ibmec表现出错定位的ZO-1和降低的TEER。总的来说,我们的结果表明,bmec的细胞旁屏障功能可能在青少年HD中保持,而bmec可能越来越容易受到病理性扰动。此外,CAG长度可能调节iBMEC表型变化的严重程度,这与CAG重复长度与HD发病年龄相关的研究结果相吻合[49]。

分化

虽然hd校正的iPSCs的分化与健康个体的其他iPSCs相似(例如神经束的形成),但HD180 iPSCs的分化是独一无二的。我们之前观察到,其他携带与不同神经退行性疾病相关突变的iPSCs在分化轨迹上存在细微差异(数据未显示)[6]。这些差异突出了比较iBMEC单层功能的一个关键挑战:如何优化分化以进行稳健的比较。由于粘附的bmec样细胞的产量取决于播种密度,因此我们在广泛的实验变量中进行了分化,以确定优化iBMEC粘附和屏障功能的条件。这种对分化方案的分析是可靠评估由基因突变引起的屏障表型差异的关键。鉴于脑血管微血管也由支持细胞类型(胶质细胞和壁细胞)组成,未来的研究将需要结合这些ipsc衍生的细胞类型来揭示细胞类型对血脑屏障功能障碍的特异性贡献。

屏障功能

虽然HD180 iBMEC单层的TEER值低于hd校正的iBMEC,但两种细胞类型的TEER值均高于500 Ω cm2超过10天。如前所述[50],在Transwells上,ibmec的TEER值不稳定;HD180 ibmec在10天内显示TEER增加,这可能表明成熟过程延迟。然而,10天的培养与cludin -5的任何富集无关,相反,与VE-cadherin连接免疫荧光的丧失有关,这表明内皮细胞的身份丧失。与这一观察结果一致的是,在2D或3D模型中,路西法黄或10 kDa葡聚糖的通透性没有统计学上的显著差异。虽然在HD180 ibmec中,细胞-细胞连接处的occludin和ZO-1染色减少,但这些差异对细胞旁屏障功能没有明显影响。Claudin-5免疫荧光在HD-corrected和HD180 ibmec中都保持强劲(如先前在其他来源iPSCs中观察到的那样)[51517]),尽管转录丰度很低。

超越势垒函数

为了探索渗透性之外的BMEC表型,我们将iBMEC单层暴露于过氧化氢、VEGF和甘露醇中。我们的研究结果表明,HD180 ibmec对氧化、血管生成和渗透应激有独特的反应,这可能使血脑屏障在HD进展过程中容易受损,并突出了潜在的治疗靶点。我们观察到HD180 ibmec更容易受到过氧化氢诱导的损伤;抗氧化剂已被用于治疗HD [51],其作用可能至少部分由血脑屏障保护介导。此外,我们观察到HD180 ibmec显示VEGFR2蛋白表达增加,并且通过增加芽密度对VEGF暴露有反应,而hd校正的ibmec的反应性有限。需要进一步的研究来确定血管生成功能障碍是由bmec直接介导,还是通过HD期间的非细胞自主作用(即星形细胞释放VEGF)介导,并使用体外模型来更好地再现血管生成发芽活性,而使用ibmec时血管生成发芽活性不强。最后,我们使用高渗剂甘露醇的研究表明,HD患者血脑屏障开放的动力学可能是独特的。鉴于TEER与小分子渗透率之间的关系大致为线性关系,在低TEER值时呈负相关[165052],我们的研究结果表明,HD180 ibmec在渗透暴露后具有更高的细胞旁通透性。

成人HD多能干细胞与成人死后HD组织分化的bmec的比较

我们证实了之前关于GLUT1的报道+和CD31+从多能干细胞分化产生的细胞含有扩增的CAG重复序列。然而,我们的结果与先前主要使用成人HD iBMECs的报告相反[5]。先前的研究使用了CAG长度为28、33、60、66、71和109的成年iPSCs(青少年病例),其TEER值为~ 4250、~ 4750、~ 3500、~ 2750、~ 100、~ 200 Ω cm2,分别。因此,CAG重复数70以上的TEER值非常低。相比之下,我们发现平均TEER值在~ 1000 Ω cm以上2用于青少年HD ibmec。我们的工作表明屏障功能的变化更为细微,与永生化和原代BMEC细胞来源相比,180 CAG重复仍然产生具有高TEER的细胞[53]。与Wnt信号相关的发现也不同;主要是成人HD iBMECs的研究表明Wnt信号异常高[1314],而在这里我们观察到HD180细胞中Wnt信号相关基因的缺失。观察到的差异可能有两个原因:(1)成人HD iPSCs具有年龄诱导的表观遗传变化,这可能导致血脑屏障功能障碍的独特模式[5[2]进一步优化成人HD iBMECs的分化方案可能导致不同的屏障表型或基因表达。如上所述,幼体hd - ibmec的分化经过优化,以产生神经束和内皮粘附,从而获得较高的TEER值。

此外,最近的研究利用死后组织的单核rna测序来表征脑血管细胞类型的基因表达差异[34],未发现HD患者中Wnt信号转录物的上调。然而,需要进一步的研究来了解HD进展过程中血脑屏障基因表达变化的时间过程和CAG长度依赖性。我们观察到HD180 iBMEC微血管中免疫细胞的粘附性升高,先天免疫激活转录物的丰度增加(IL4RCCR1趋化因子受体CXCR4IL17RDCXCL12),而先天性免疫激活的关键启动物和介质在HD死后组织的脑内皮细胞中上调[34]。需要进一步的研究来确定HD bmec中先天免疫激活的机制;鉴于最近扩展iBMEC分化方案的工作可能有助于促进这些体外研究[54]。

结论

总之,我们使用等基因幼年HD iPSCs显示了扩增CAG重复序列对iBMEC表型的影响。CAG在HD180 ibmec幼体中的扩增导致跨内皮电阻降低,紧密连接蛋白的表达减少,以及独特的基因表达谱,但细胞旁通透性没有显著变化。然而,幼年HD180 ibmec对病理性和治疗性扰动(包括血管生成因子、氧化应激和渗透应激)表现出独特的反应。我们还证明,通过探索细胞周转和免疫细胞粘附的独特动力学,组织工程体外血脑屏障模型支持神经退行性疾病的机制和治疗研究。我们的研究结果表明,青少年HD期间可能发生明显的脑血管变化,这取决于CAG扩张的程度,应该使用包含更大范围CAG重复长度的等基因面板进一步探索[55]。

数据可用性

如有合理要求,通讯作者可提供再现这些发现所需的原始/处理过的数据。

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致谢

这项工作得到了DTRA (HDTRA1-15-1-0046)和NIH (NINDS R01NS106008和NHLBI R61HL154252)的支持。RML承认国家科学基金会研究生研究奖学金,资助号:DGE1746891。RFN和GG承认霍普金斯大学本科生研究办公室(HOUR)颁发的教务长本科生研究奖(PURA)。作者感谢新加坡国立大学Pouladi实验室提供的等基因少年型HD iPSCs。

作者信息

作者及单位

作者

贡献

RML和PCS构思了这项研究并撰写了论文。RML、RFN和PCS设计了2D和3D实验。RML, RFN, DA, GG进行二维实验并进行分析。RML和ZG进行并分析了3D实验。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到彼得·c·西尔森

道德声明

相互竞争的利益

作者声明无利益冲突。

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林维尔,r.m.,尼伦伯格,r.f.,格里夫诺,G。et al。亨廷顿氏病等基因少年iPSC模型中的脑微血管内皮细胞功能障碍。流体屏障19, 54(2022)。https://doi.org/10.1186/s12987-022-00347-7

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关键字

  • 血脑屏障
  • 亨廷顿氏舞蹈症
  • 脑微血管内皮细胞
  • 神经退行性疾病
  • 诱导多能干细胞