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乙酰唑胺通过作用于脑脊液分泌器直接调节颅内压beplay靠谱

摘要

背景

颅内压升高可在许多神经系统疾病中观察到,例如脑积水和中风。这种情况通常通过神经外科方法缓解,因为有效和有针对性的药物工具仍然缺乏。碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺(AZE)可用于治疗升高的ICP。然而,其有效性受到质疑,其作用地点尚未确定,其容忍度低。在此,我们测定了AZE在大鼠体内的药效和作用方式。

方法

我们采用了体内方法,包括麻醉大鼠的ICP和脑脊液分泌测量,清醒大鼠的ICP和血压遥测监测,并结合体beplay靠谱外脉络膜放射性同位素通量测定和转录组分析。

结果

AZE可有效降低颅内压,与给药方式和麻醉水平无关。这种效果似乎是通过直接作用于脉络膜丛和相关的脑脊液分泌减少而发生的,而不是通过AZE对肾脏和血管过程的全身作用间接发生的。beplay靠谱单次给药后,颅内压降低持续约10小时,脑含水量或脉络膜转运蛋白表达未发生长期变化。然而,通过全天重复AZE管理,确保了ICP的持续降低。

结论

AZE通过其减少脉络膜丛CSF分泌的能力直接降低ICP,与给药方式无关。

介绍

颅内压升高(ICP)可在多种脑病中观察到。它导致脑组织空间受压和脑灌注减少,如果不及时治疗,可导致脑缺血,并可能致命[1]。颅内压升高的治疗很大程度上依赖于手术干预,脑积水患者最常见的是脑室-腹膜分流术,严重脑水肿患者则需要颅脑切除术[2]。只有少数药物可用于缓解升高的ICP,最广泛使用的是Diamox®,其活性成分为乙酰唑胺(AZE) [3.]。AZE是碳酸酐酶的抑制剂,碳酸酐酶的15种同工型在哺乳动物体内的不同细胞类型和组织中广泛表达[4]。这些酶催化一氧化碳的可逆转化2到H2有限公司3.,然后解离成氢离子(H+)和碳酸氢盐(HCO)3.)。AZE于20世纪50年代初作为利尿剂推出[5],后来被用于治疗ICP升高[67]。虽然AZE已被证明可以降低人类的ICP [7],其治疗颅内压升高疾病的有效性受到质疑[89]。由于其广泛表达,AZE治疗伴有一系列全身副作用,如感觉异常、嗅觉障碍、多尿和疲劳[10]。AZE治疗效率的不确定性,加上患者依从性差,引发了对其临床可用性的质疑[11]。然而,由于缺乏替代方案,AZE仍然是某些ICP病理的一线治疗方法,例如特发性颅内高压[12],而不考虑药物缓解升高的ICP的作用模式。对实验大鼠的研究表明AZE可有效降低ICP [1314],然而,这在生理相关剂量和等摩尔试验溶液中不太明显[15]。

与其对颅内压的不明确影响相反,有可靠的(预)临床数据支持AZE在降低人脑脊液(CSF)分泌方面的功效[beplay靠谱1617]以及不同的实验动物模型,例如绵羊[18],狗[19],兔子[20.21222324],猫[25262728]和老鼠[2930.31(要回顾,参见[32])。大部分脑脊液是由脉络膜丛分泌的[33],它是一种上皮单层,具有多种离子转运体和通道的极化表达[3435]。在这些脉络膜运输机制中有几种HCO3.转运体,即钠驱动的氯碳酸盐交换剂(NBCn2/NCBE) [36]和阴离子交换剂2 (AE2) [37]存在于基底侧膜中,而碳酸氢钠共转运蛋白2 (NBCe2)在腔膜中表达[3839],这些都可能与脑脊液分泌有关[4041]。这些转运体的活性是由它们的底物(HCO)的有效性决定的3.)。脉络膜碳酸酐酶的抑制作用[4243444546],以及随后的[HCO]的减少3.因此,可能直接影响转运率和相关的脑脊液分泌。然而,脑脊液分泌的速率也可能作为体内其他部位碳酸酐酶抑制的次要效应而被调节。这种aze介导的生理参数调节的一个例子发生在肾脏,其中碳酸酐酶介导的HCO3.HCO的再吸收需要转化3.47]。因此,抑制肾碳酸酐酶可能间接降低HCO的活性3.脉络膜丛中的转运蛋白通过简单地降低血液中的HCO3.,从而限制了对其运输基质的接触。此外,aze介导的肾HCO的减少3.重吸收引起利尿,从而降低平均动脉血压(MAP) [4849]。MAP的改变可能间接影响脑脊液分泌[50],从而可以以这种方式降低ICP。此外,红细胞和周围毛细血管内皮中的碳酸酐酶支持有效的一氧化碳2组织-血-肺泡间的交换[51]。抑制这些血管碳酸酐酶会导致全身二氧化碳分压(pCO)升高2) [5253]和随后的过度通气,这可能间接降低ICP [54]。因此,在实验过程中没有机械通气的麻醉动物的不受控制的呼吸可能是先前评估aze介导的脑脊液分泌或ICP影响的临床前研究的一个混淆因素[55]。

因此,AZE可能是一种临床上有用的药物,用于降低神经系统疾病的ICP。然而,目前尚不清楚aze介导的脑脊液分泌减少是否确实导致相关的ICP降低。另一个关键问题是脑脊液分泌减少是由AZE对脉络膜碳酸酐酶的直接作用引起的,还是继发于AZE对其他生理过程(如血压、肾功能和/或血气含量)的调节作用。在这里,我们通过互补来证明体外在活的有机体内在麻醉大鼠和清醒大鼠的实验方法中,AZE通过its降低了健康大鼠的ICP直接行动脉络膜碳酸酐酶和随后的脑脊液分泌减少。这一新发现可能指导未来针对脉络膜丛的ICP升高的药物治疗。

方法

动物

实验是在9-10周龄的雄性斯普拉格·道利大鼠中进行的,它们被安置在一个温度控制的房间里,有12小时:12小时的明暗循环(早上6点到下午6点),并且可以自由地使用标准的啮齿动物颗粒饮食和自来水。动物被随机分配到每个治疗组。所有动物实验工作的进行和报告均符合reach准则[56],符合欧洲共同体理事会指令(2010/63/EU)中的动物保护和护理立法,并经丹麦动物实验监察局批准(许可证号:2016-10-01 -00944和2018-15-01 -01595)或塞尔多夫海因里希·海涅大学动物护理和使用设施的动物福利办公室(机构法案号:O52/05)。

AZE和控制溶液配方

静脉给药时,AZE (A6011, Sigma-Aldrich)溶于5 N NaOH至700 mg ml−1原液,用0.9% NaCl稀释至工作浓度为20 mg ml−1pH值8.4。对照溶液为等摩尔1.4% NaCl溶液,pH为8.4。溶液(5ml kg−1动物)分别注射于股静脉或尾静脉,剂量为100mg AZE kg−1动物(相当于人临床单次剂量)[15])。对于脑室内给药,AZE溶解在DMSO (1-2.5 M)中,并在两种HCO中进一步稀释3.-含人工CSF (aCSF);(mM) 120 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2、1.3 MgSO4, 1不2阿宝4葡萄糖10个,NaHCO 25个3., pH值调整95% O2/ 5%股份有限公司2)或hepes缓冲人工脑脊液(HEPES-aCSF;(mM) 120 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2、1.3 MgSO4, 1不2阿宝4, 10葡萄糖,17 Na-HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸),pH 7.4),当溶液不能与95% O平衡时2/ 5%股份有限公司2(离体)麻醉大鼠放射性同位素通量和ICP记录)。根据实验范例(见下文),配制最终的工作溶液,将脉络膜丛组织暴露在200µM至< 1 mM(见下文)AZE浓度下,该浓度应阻断碳酸酐酶99.99% [57]。车辆包括匹配DMSO浓度(最大0.1%),并在需要时添加甘露醇,以获得等摩尔溶液。慢性口服(p.o)给药时,AZE混悬液(0.9% NaCl, 50 mg ml)−1)按0.9 ~ 1.0 ml的剂量给实验大鼠,剂量为100 mg kg−1动物AZE每天1次,连用7天(上午10点)或每天3次(上午7点、下午2点和晚上9点)灌胃,连用5天。对照组动物灌胃生理盐水。

麻醉及生理参数监测

所有非存活手术均在用氯胺酮(ScanVet, 10 mg kg)和噻嗪麻醉的大鼠进行−1动物用噻嗪,5分钟后100 mg kg−1动物氯胺酮,检测足部反射后每10-40 min重新给药半剂量氯胺酮)。恒温监测系统(Harvard Apparatus)将体温维持在37°C。在持续时间超过30分钟的实验中,大鼠气管造口并使用VentElite系统(Harvard Apparatus)进行机械通气,吸入0.9 l min−1加湿空气混合0.1 l min−1O2.根据呼出的尾潮CO调节通风2(etCO2),用毛细管仪(340型,哈佛仪器)测量,得到5.0±0.5 kPa的血pCO2在给药之前。在过度通气实验中,在基线期使用的通气量增加50%(呼吸率和潮气量),然后在整个2小时的实验中保持在这些水平。MAP通过肝素化盐水填充(15 IU肝素ml)监测−1将导管插入股动脉,连接压力传感器APT300和传感器放大器模块TAM-A (Hugo Sachs Elektronik)。使用BDAS基本数据采集软件(Hugo Sachs Elektronik)以1khz采样率记录血压信号。该导管还用于ABL80(辐射计)测定血气所需的血液样本采集。所有存活手术均在无菌条件下用异氟醚(阿坦尼,1000 mg g)麻醉大鼠进行−1异氟烷,ScanVet),使用5%异氟烷(混合1.8 l min−1空气/0.2升min−1O2在麻醉诱导室中使用1-2.5%异氟醚,在整个手术过程中通过面罩维持麻醉。恒温监测系统(Harvard Apparatus)将体温维持在37°C。

麻醉大鼠颅内压记录

麻醉和通气的大鼠置于立体定向框架中,暴露颅骨,钻一个直径3.6 mm的颅窗,小心不要损伤硬脑膜。硬膜外探针(PlasticsOne, C313G)用牙科树脂水泥(Panavia SA cement, Kuraray Noritake dental Inc.)固定,ICP套管填充hepe - acsf,然后连接压力传感器APT300和传感器放大器模块tama (Hugo Sachs Elektronik)。为了确保硬脑膜和硬膜外探头之间存在连续的液柱,通过硬膜外探头注入约5µl HEPES-aCSF。使用BDAS基本数据采集软件(Hugo Sachs Elektronik)以1khz采样率记录ICP信号。颈静脉压迫确认正确的颅内压记录。在颅内压记录中,在颅内压探头的对侧钻孔0.5 mm(后1.3 mm,脑室外侧1.8 mm),并在侧脑室放置一个4 mm的脑输注套管(脑输注套件2,Alzet)。ICP信号稳定后,注入37°C aCSF + 0.9% DMSO (0.5 μ l min)−1)在溶液转移到对照溶液(aCSF +甘露醇+ 0.9% DMSO)或AZE (aCSF + 18mm AZE在0.9% DMSO中)之前,用蠕动泵进行25min;预期心室浓度≤1mm(在150µl的心室室室中稀释,另外以大约7µl min的速率连续分泌脑脊液产生的浓度。−158]以及随后从脉络膜丛上皮表面冲走AZE)。该剂量相当于0.24毫克的动物累积剂量−1实验时间为120分钟。在静脉滴注试验溶液的ICP实验中,这些溶液通过充满肝素的盐碱(15 U肝素ml)注入股静脉−10.9% NaCl)导管(100 mg kg)−1动物)。

肾切除术

麻醉大鼠在脊髓外侧背部开2个切口,钝性剥离肌层,暴露双肾。定位肾动静脉,用4−0不可吸收缝线结扎。结扎后用金属伤口夹(Michel, 11 × 2mm)闭合切口部位。

LI-COR实时成像

在立体定位框架中麻醉的大鼠暴露其头盖骨和上颈部肌肉,钻一个毛刺孔(与ICP记录中颅内压插管放置的坐标相同),将Hamilton注射器(rn0.40, G27, a20, Agntho)插入侧脑室4mm。实验开始于脑室内注射(1.5µl s)−1) 15µl aCSF,其中含有载体(0.1% DMSO)或AZE (2 mM);由于在~ 150µl天然CSF中稀释,预期心室浓度为200µM)。5分钟后重复该过程,但加入羧酸盐染料(10µM;IRDye 800CW, P/N 929-08972, LI-COR Biosciences)。实验中,AZE (100mg kg)静脉注射−1动物),在注射羧酸盐染料前25分钟,通过24 G Neoflon, VWR导管将药物注射到尾静脉。使用Pearl Trilogy小动物成像系统(LI-COR) (800 nm通道,85 μm分辨率),在注射羧酸盐后1分钟开始图像采集,持续5分钟,间隔30 s。在成像过程中,将麻醉后的大鼠固定在特制的牙架中以稳定其头部位置。荧光信号作为时间的函数在头骨标记lambda处的感兴趣区域(ROI)中测定,并相对于0.5 s时获得的初始荧光强度进行盲法量化。在成像结束时捕获大鼠头部的白场图像,然后观察分离的大脑半球的侧脑室,以验证双侧羧酸盐染色。数据分析在Image Studio 5.2 (LI-COR Biosciences - GmbH, Nebraska, US)中进行。

放射性同位素通量测定

分离外侧脉络膜丛前,将离体大鼠脑置于低温HEPES-aCSF(4℃,pH 7.35)中保存10 min [59]。实验开始前,将离体外侧脉络丛置于HEPES-aCSF (pH 7.56, 37°C)中10分钟。86Rb+内流:实验开始时,将脉络膜丛置于含有1µCi ml的HEPES-aCSF中−1 86Rb+(022-105721-00321-0001, POLATOM,作为K的示踪剂+运输)和4µCi ml−1 3h -甘露醇(作为细胞外标记物,PerkinElmer)在37°C下,在2 mM瓦巴因(O3125, Sigma)、200µM AZE或适当的载体(随机分配)存在下,持续2分钟,之后,在冷的无同位素HEPES-aCSF(4°C)中迅速冲洗脉膜神经,并转移到闪烁瓶中。86Rb+外排:将脉络膜丛置于含有1µCi ml的HEPES-aCSF中开始实验−1 86Rb+(022-105721-00321-0001, POLATOM,作为K的示踪剂+运输)和4µCi ml−1 3h -甘露醇(作为细胞外标记物,PerkinElmer)在37°C下加热10分钟,使同位素在组织中积累。脉络膜丛在37°C HEPES-aCSF中短暂洗涤(15 s),然后(每隔20 s)转移到含有200µM AZE, 20µM布美他尼(B3023, Sigma)或适当载体的不同HEPES-aCSF溶液(37°C)中,共60 s。每个溶液的流出介质被转移到单独的闪烁小瓶中,脉络膜丛也是如此。对于内流和外排试验,脉络膜丛溶解在100µl溶液中(6NE9100, Perkin Elmer)。在所有闪烁小瓶中加入500µl Ultima Gold™XR闪烁液(6,012,119,PerkinElmer),并在Tri-Carb 2900TR液体闪烁分析仪(Packard)中定量放射性含量。的86Rb+计数已根据3.H甘露醇计数(细胞外背景)和脉络膜丛含量A的自然对数t/一个0是按时间计划的[60]以取得86Rb+流出率(s−1)进行线性回归分析。

细胞内钠+测量

将离体外侧脉络膜丛移入记录室,灌注HCO3.-aCSF室温(22±1℃)约20分钟。随后,Na+-敏感荧光染料SBFI-AM(钠结合苯并呋喃二苯二甲酸乙氧基甲基酯,2021E, ION Biosciences,溶解于20% Pluronic, F127)使用细端玻璃微移液管连接压力应用系统(PDES nxh, npi电子,Tamm,德国),加压注射到脉络丛的几个区域。随后用HCO灌注组织3.-aCSF (45分钟)洗掉多余的染料并允许去酯化。广角Na+使用可变扫描数字成像系统(Nikon NIS-Elements v4.3, Nikon GmbH)与直立显微镜(Nikon Eclipsle FN-PT, Nikon GmbH)耦合获得成像。显微镜配备×40/N.A.0.8 LUMPlanFI浸入式物镜(Olympus Deutschland GmbH)和orca FLASH V2相机(Hamamatsu Photonics Deutschland GmbH)。SBFI在340和380 nm处交替激发,以0.5 Hz的采样率收集> 440 nm的发射。从代表单个细胞的定义感兴趣区域(ROI)记录荧光发射,在HCO中持续2分钟3.-基线条件下acsf,然后灌注HCO3.-含200µM AZE或0.02% DMSO(对照)的acsf,再成像30分钟。使用OriginPro软件(OriginLab Corporation v.9.0)分析SBFI信号。对每个ROI进行背景校正,得到荧光比(F340/F380)。采用盲法对对照期和用药期进行线性回归分析。

RNAseq

脉络膜丛(外侧和4th),分别从5只经aze处理的大鼠和5只对照大鼠中分离,合并保存在RNAlater®中,保存温度为- 80°C。RNA提取和文库制备由Novogene Company Limited, UK使用NEB Next®Ultra™RNA library Prep Kit (NEB, USA)进行,然后在Illumina NovaSeq 6000 (Illumina, USA)上进行RNA测序(配对端150bp,输出12gb)。程序参数设置库构建,制图,和定量,连同脚本基因注释和分析可以在https://github.com/Sorennorge/MacAulayLab-RNAseq2-Acetazolamide.使用Spliced Transcripts Alignment to a Reference (STAR) RNA-seq aligner (v 2.7.2a),将150个碱基配对的末端reads定位到参考基因组Rnor_6.0 (Rattus_norvegicus v.103),仅包括蛋白质编码基因(生物型)[61]。STAR生成的映射比对被归一化为每百万转录本(TPM) [62]与RSEM (v. 1.3.3)。人脉络膜丛的RNA测序数据来自Rodríguez-Lorenzo等人(Geo: GSE137619, SRR10134643-SRR10134648) [63],小鼠脉络膜丛的RNA测序数据来源于Lun等人(Geo: GSE66312, SRR1819706-SRR18197014) [64]。所有人类和小鼠样品均使用fastqc进行质量检查[65],然后用Trimmomatic [66(滑动窗口:4:20,最小长度为35bp)。利用STAR (v 2.7.2a)将人类和小鼠样本分别定位为参考人类基因组(Homo sapiens GRCh38.104)和小鼠参考基因组(Mus musculus GRCm39.104),两者均仅包含蛋白质编码基因(生物型)。使用RSEM (v. 1.3.3)将图谱比对量化为TPM,并使用人和小鼠样本的平均值进行进一步分析。

Ventricular-cisternal灌注

将大鼠麻醉、通气,将输注套管(Brain infusion kit 2, Alzet)立体放置于右侧脑室(与ICP测量所描述的一样),通过预热(37°C, SF-28, Warner Instruments)的HCO3.-aCSF含1mg ml−1tritc -葡聚糖(四甲基罗丹明异硫氰酸酯-葡聚糖,MW = 150000;T1287 (Sigma)以9µl min滴注−1.隔5分钟用玻璃毛细管(30-0067,Harvard Apparatus,由Brown Micropipette pull, Model P-97, Sutter Instruments)以5°角(枕骨远端7.5 mm,肌肉中线外侧1.5 mm)从大池取样脑脊液。在545 nm的SyneryTM Neo2多模式微孔板检测器上,一式三次检测CSF流出液的荧光含量;BioTek Instruments),脑脊液分泌率由式计算:

$ $ V_ {p} = r_{我}* \压裂{C_{我}-C_ {o}} {C_ {o}} $ $

在哪里Vp=脑脊液分泌率(µl min)−1),r=输注速率(µl min)−1),C=流入溶液的荧光;Co=流出液的荧光。脑室灌注80 min,用最后20 min的产率盲法计算动物平均脑脊液分泌率。

脑含水量

大脑,包括小脑和嗅腺体,被迅速从麻醉和斩首的大鼠中分离出来,剩余的脑干被移除。大脑被放置在一个预先称重的瓷蒸发烧杯中(嗅球和延髓被丢弃),并立即称重。在100°C烤箱干燥3天之前,用钢杵将脑在烧杯中均匀化,随后测定干脑重量。脑水含量由蒸发水计算,并以每克干脑重ml水表示,采用盲法。

清醒大鼠ICP和MAP监测

采用KAHA科学大鼠双压遥测系统监测未麻醉、清醒大鼠的ICP和MAP。植入按照[67]。简单地说,给动物5 mg kg−1卡洛芬(Norodyl Vet, Norbrook), 0.05 mg kg−1丁丙诺啡(Tamgesic, individual), 200 mg + 40 mg kg−1手术前和术后2天服用磺胺嘧啶和甲氧苄啶(Borgal Vet, Ceva)。切开部位刮刀,用0.5%氯己定消毒。在腹部中线切开,分离腹主动脉,用弯曲的23G针将第一根压力探头插入主动脉。用组织胶粘剂(Histoacryl, enbucrate;B. Braun)和外科补片(PETKM2002, SurgicalMesh;纺织发展协会)。遥测装置的主体固定在腹壁上,使用4 - 0可吸收的Vicryl缝线(Ethicon)闭合腹肌。使用直径6毫米的不锈钢吸管(Ecostrawz)将突出的第二个压力探头穿入颅骨底部。将动物置于立体定向框架(哈佛装置)中,暴露颅骨。使用1.2 mm毛刺钻头,在颅骨后侧对侧钻两个孔。 Stainless steel screws (00-96 × 3/32, Bilaney Consultants GmbH) were inserted into these holes, and served as anchors for stabilizing the system. The second pressure probe was placed epidurally in a third 1.4 mm drill hole placed between the two screws. The hole was subsequently filled with spongostan (Ethicon), and the probe was secured using surgical mesh and tissue adhesive. Dental impression material (Take 1 Advanced, Kerr) was applied over the catheter and the screw, and the skin incision was closed with non-absorbable 4 − 0 EthilonII suture (Ethicon), which was removed 10 days post-surgery. Animals were placed in their cages on the TR181 Smart Pads (Kaha Sciences), and data acquisition obtained at 1 kHz with PowerLab and LabChart software (v8.0, ADInstruments). Data was extracted from LabChart as 6 min average values and outlying data points identified with GraphPad Prism (GraphPad Software). During the experimental series with 1× day AZE treatment, day 5 was discarded from the analysis due to the weekly cage change, which caused a visible disturbance in all measured parameters. The 3× day dosing experiments were performed on same animals that received 1× day dosing seven days after recovery from the previous treatment.

统计数据

所有数据均以平均值±SD表示。采用GraphPad Prism (GraphPad Software)软件进行统计学意义分析,以P < 0.05为差异有统计学意义。经夏皮罗-威尔克检验,数据呈正态分布。统计分析采用单因素方差分析采用Tukey’s多重比较事后检验,双因素方差分析采用Bonferroni’s或Tukey’s多重比较事后检验,配对和非配对t检验,如图图例所示。柱状图上方以星号表示显著性,表示P > 0.05 = ns, P≤0.05 = *,P≤0.01 = **,P≤0.001 = ***。

结果

AZE有效降低ICP

为了确定AZE对麻醉和通气大鼠颅内压的调节作用,我们在记录颅内压的同时,全身静脉注射AZE。实验大鼠颅底ICP为4.2±0.8 mmHg, n = 34。我们观察到,在AZE给药后,ICP立即急剧上升(至133±14%,n = 5),随后在注射后2小时,ICP逐渐下降至低于基线水平的-48±10%,n = 5(图5)。1A, B)。对照动物(给药)没有经历最初的ICP峰值(103±3%,n = 5),随后的ICP随时间下降比基线水平低-25±7%,n = 5(图5)。1A, B),显著低于aze处理大鼠(P < 0.01)。AZE因其降低血压的作用而被认可[49],进而影响ICP和/或CSF的分泌[50]。因此,在进行ICP测量的同时,我们记录了平均动脉压(MAP)。初始MAP为71.7±7.2 mmHg, n = 34。在实验期间,两个实验动物组的MAP保持稳定(AZE处理大鼠为-5±5%,对照组为- 6±7%,n = 5, P = 0.9,图。1因此,AZE以一种独立于MAP的方式对ICP施加影响。

图1
图1

麻醉和通气大鼠静脉注射AZE的影响。ICP (一个),地图(C)及etCO2E)表示5分钟平均值归一化到基线(10分钟平均值前获得对照溶液或AZE, 100 mg kg−1)作为时间的函数。注射后2小时与基线的变化显示为ICP (B, n = 5, P < 0.01,未配对t检验)和MAP (D, n = 5, P = 0.9,非配对t检验)。在注射前(0 h)和注射后1、2 h进行血气分析,并给出pCO的结果2F(n = 5, 0 h时P > 0.9, 1和2 h时P < 0.001, Bonferroni事后分析的双因素方差分析)和血液HCO3.G, n = 5,时间变量P < 0.001,治疗变量P < 0.05,见上图,双因素方差分析)。箭头为静脉注射时间。ICP -颅内压,MAP -平均动脉压,etCO2-末潮汐二氧化碳,pCO2-二氧化碳分压,CTRL -控制,AZE -乙酰唑胺。数据以mean±SD表示。*;P < 0.05, **;P < 0.01, ***;P < 0.001, ns;不显著。

AZE影响全身酸碱平衡

作为碳酸酐酶的抑制剂,AZE影响CO2-HCO3.因此,AZE在红细胞中的转化和全身递送可能以间接影响CSF分泌或其他生理过程的方式影响血气。因此,我们监测呼出的etCO2麻醉和通气实验大鼠以恒定速率。与对照动物(100±1%,n = 5)相比,AZE引起etCO突然下降2(降低了-32±1%,n = 5, P < 0.001), etCO仍然降低(比基线etCO低-9±3%)2),实验结束时(图2)。1E). etCO的这种转变2在血液pCO中有所反映吗2,在对照动物中保持稳定,但在AZE处理大鼠中急剧增加(从5.2±0.4 kPa到10.1±0.4 kPa), n = 5, P < 0.001,图。1因此,与对照组相比,AZE动物的血液pH值降低(参见附加文件中的所有血气分析)1:表1)。综上所述,呼出的etCO减少2,血液pCO升高2pH值下降提示严重的呼吸性酸中毒,这是由于肺内皮和循环红细胞中碳酸酐酶的抑制所致。血液中的HCO3.实验组(23.7±0.8 mM至21.1±1.3 mM, n = 5)比对照组(23.0±0.9 mM至19.3±0.7 mM, n = 4)下降幅度更大(P < 0.05)。1G),提示伴有代谢性酸中毒。因此,全身给药AZE可引起严重的酸碱紊乱,间接影响ICP和/或CSF分泌。

AZE对ICP的影响独立于系统水稳态

aze诱导的系统HCO变化3.可能是通过AZE对肾近端小管上皮碳酸酐酶的抑制作用而发生的[47]。这样的过程会损害HCO3.重吸收和诱导利尿[68],这可能导致ICP降低。为了确定AZE是否通过其对肾脏的作用间接对ICP产生影响,我们测定了AZE给药对肾切除大鼠的影响(图2)。2A). AZE治疗降低了肾切除大鼠的ICP(-47±6%,n = 4,图。2B),这与未切除肾的大鼠观察到的结果相似(与−48±10%相比,图2)。1A)。无论动物是否进行了肾切除术,对照处理对大鼠的ICP降低相似(比较27±12%,n = 4,图2)。2B为- 25±7%,图中n = 5。1A)。在所有实验大鼠中,不论AZE给药与否,肾切除术均导致MAP类似的下降(对照组为-30±18%,AZE组为31±11%,各n = 4, P = 0.9,图。2C, D).同样,aze诱导的etCO的变化2和pCO2在肾脏切除和完整的动物之间无法区分(图2)。2E, F,所有血气分析都在附加文件中1表2)。基线HCO3.两组实验动物的HCO水平均降低(未切除动物为23.4±0.9 mM, n = 9,肾切除动物为21.6±1.3 mM, n = 8, P < 0.01),可能是由于缺乏HCO3.被切除的肾的重吸收。血液中的HCO3.水平在实验过程中下降(在完整的动物中观察到,图2)。1G),但无aze诱导的HCO变化3.肾切除大鼠的重吸收(图2)。2G)。综上所述,结果表明AZE对ICP的影响独立于其对肾功能(包括其HCO)的抑制作用3.处理),从而达到系统的水稳态。

图2
图2

AZE对麻醉、通气和去肾大鼠静脉注射的影响。ICP (一个),地图(C)及etCO2E)以与图1相同的方式呈现。1,以及静脉注射(100 mg kg)后2 h的变化−1)查阅ICP (B, n = 4, PCTRL−CTRL (N)= 0.9, pCTRL (N)−AZE (N)< 0.05, pAZE−AZE (N)= 0.9,采用Tukey事后分析的单因素方差分析)和MAP (D, n = 4, PCTRL−CTRL (N)< 0.05, pCTRL (N)−AZE (N)= 0.9, pAZE−AZE (N)< 0.05,采用Tukey事后分析的单因素方差分析)。给出了pCO的血气分析结果2F, n = 4,星号表示0 h时CTRL(n)- aze (n)比较有显著性,1和2 h时P < 0.001,采用Tukey事后分析的双因素方差分析)和血HCO3., (G(n = 4,时间变量P < 0.001,治疗变量P = 0.4,见上图,双因素方差分析)。深灰色和浅灰色结果由图。1.箭头为静脉注射时间。ICP -颅内压,MAP -平均动脉压,etCO2-末潮汐二氧化碳,pCO2-二氧化碳分压,CTRL -控制,AZE -乙酰唑胺。(N) =肾切除大鼠。数据以mean±SD表示。*;P < 0.05, ***;P < 0.001, ns;不显著。

过度通气并不妨碍AZE降低ICP的能力

确定AZE是否通过改变CO以间接方式对ICP产生影响2我们试图阻止aze诱导的CO2在实验过程中,动物机械过度通气在血液中的滞留。血气分析(附加文件1表S3)显示过度通气导致pCO降低3.5 kPa2实验结束时,对照组动物(从完整动物的5.4±0.3 kPa, n = 5降至过度通气动物的1.9±0.1 kPa, n = 4, P < 0.001),而aze处理动物(从完整动物的10.1±0.4 kPa, n = 5降至过度通气动物的8.4±0.7 kPa, n = 4, P < 0.05)减少了1.6 kPa。3.A).因此,过度通气不能恢复aze诱导的pCO变化2达到对照动物的水平(图2)。3.A).尽管部分预防了aze诱导的血CO升高2AZE治疗导致ICP降低(-65±7%,n = 4,图4)。3.B, C),与常规通气相比(-48±10%,n = 5,图5)。1A, P < 0.05),但在过度通气的对照动物中未观察到相同的情况(图中n = 4, P < 0.05)。3.C为25±7%,图中n = 5。1A)。在对照组(-30±1%,n = 4)和AZE组(-24±10%,n = 4)中,过度通气降低MAP的程度相似(P = 0.3)。3.E, F),支持图2的发现。1D . AZE治疗没有降低MAP。综上所述,aze诱导血液pCO升高2并不有助于ICP的降低。

图3
图3

静脉注射AZE对麻醉和过度通气大鼠的影响。注射后(100 mg kg) 5分钟内,将潮气量和呼吸速率从基线值增加50%,诱导过度通气−1),导致pCO2减少(一个, n = 4,黑色星号表示CTRL(H)-AZE(H)比较具有显著性,0 H时P = 0.9, 1和2 H时P < 0.001;深灰色星号表示CTRL-CTRL(H)比较,0 H时P = 0.1, 1和2 H时P < 0.001;浅灰色星号表示AZE-AZE(H)比较,0 H时P = 0.3, 1 H时P < 0.001, 2 H时P < 0.05,采用Tukey事后分析的双因素方差分析)。ICP (B)及地图(D)表示为时间的函数,其方式与图1所示相同。1, 2h的变化如C(n = 4, PCTRL−CTRL (H)= 0.9, pCTRL (H)−AZE (H)< 0.001, pAZE−AZE (H)< 0.05,采用Tukey事后分析的单因素方差分析)E(n = 4, PCTRL−CTRL (H)< 0.001, pCTRL (H)−AZE (H)= 0.6, pAZE−AZE (H)< 0.01,采用Tukey事后分析的单因素方差分析)。深灰色和浅灰色结果由图。1.箭头为静脉注射时间。pCO2-二氧化碳分压,ICP -颅内压,MAP -平均动脉压,CTRL -控制,AZE -乙酰唑胺。(H) =过度通气大鼠。数据以mean±SD表示。*;P < 0.05, **;P < 0.01, ***;P < 0.001, ns;不显著。

脑室内AZE可防止全身紊乱,但保留其降低ICP的作用

因此,AZE有助于降低ICP,而不依赖于其对血压、肾功能和血气含量的影响。为了获得AZE可以在没有系统干扰的情况下施用的情况,我们将AZE应用于脑室内(i.c.v)。将AZE直接注入麻醉大鼠侧脑室未干扰MAP(图2)。4A, B)血液pCO2(无花果。4C),血液中的HCO3.浓度(图。4D),或任何其他血气参数,包括pH值(附加文件1:表S4)。然而,以这种方式给药AZE导致颅内压降低(- 51±10%,n = 4),显著大于对照组(- 16±14%,n = 4, P < 0.01)。4E, F),但与静脉注射抑制剂(-48±10%,n = 5)得到的结果相似,见图。1A)。此外,系统递送AZE时观察到AZE介导的初始ICP峰(图2)。1A)在体外灌注抑制剂时不存在(图2)。4E).因此,直接将AZE注入大脑与全身给药同样有效地降低ICP,但不依赖于AZE介导的可能间接影响ICP的全身参数的调节。因此,AZE似乎通过驻留在脑组织中的途径对ICP起调节作用。

图4
图4

静脉滴注AZE对麻醉和通气大鼠的影响。地图(一个)以与图1相同的方式呈现。1, 2h端MAP示于B(Δ地图CTRL(我)= -6±6%,ΔmapAZE(我)= -7±2%,n = 4, P > 0.9,采用Tukey事后分析的单因素方差分析),以及血液pCO2C(n = 4, 0和2 h时P > 0.99, 1 h时P = 0.7,采用Tukey事后分析的双因素方差分析)和血HCO3., (D(n = 4,时间变量P < 0.001,治疗变量P = 0.1,见上图,双因素方差分析,)。AZE的作用(18 mM, 0.5µl min)−1;预期心室浓度≤1mm稀释后,见方法)作为时间的函数示于E,末端改变2hF(n = 4, PCTRL−CTRL(我)= 0.6, pCTRL (I)−AZE(我)> 0.01, pAZE−AZE(我)> 0.9,采用Tukey事后分析的单因素方差分析)。深灰色和浅灰色结果由图。1.箭头表示开始静脉注射。MAP -平均动脉压,pCO2-二氧化碳分压,ICP -颅内压,CTRL -控制,AZE -乙酰唑胺。(I) =灌胃AZE的大鼠。数据以mean±SD表示。* *;P < 0.01, ns;不显著。

AZE治疗降低麻醉大鼠脑脊液流量

为了确定aze介导的颅内压降低是否通过脑脊液分泌速率的降低而发生,我们采用了一种基于麻醉大鼠脑室荧光染料成像流的快速、微创方法来评估该参数[59(图。5A)。AZE处理后荧光染料的移动减少了40%,无论抑制剂是否给药(相比0.16±0.02 a.u. min)−1, n = 4, 0.10±0.03 a.u. min−1, n = 4, P < 0.05,图3。5B)或静脉注射(比较0.16±0.05 a.u. min−1, n = 6, 0.09±0.03 a.u. min−1, n = 4, P < 0.05,图3。5C).因此AZE对ICP的影响,至少部分是通过降低脑脊液分泌率来实现的。

图5
图5

AZE治疗后荧光染料实时成像作为脑脊液分泌的代表。最上面的面板一个图示在大鼠心室注射IRDye 800 CW羧酸染料后,在白光图像上叠加的伪彩色荧光。lambda(颅骨标志)下方的白色方框表示染料强度量化区域。下图显示了在体外循环注射对照溶液或2 mM AZE溶液(预期心室浓度200µM,见方法)后0.5和5min荧光信号的代表性图像。定量染料流表示为任意单位(a.u)归一化到第一张图像后的i.c.v.注射显示在面板中B(n = 4, P < 0.05,非配对t检验)。面板C显示在静脉注射对照溶液或100mg kg后归一化到第一张图像的染料流的定量−1AZE (nCTRL= 6, nAZE= 4, P < 0.05,非配对t检验)。CTRL - control, AZE -乙酰唑胺。数据以mean±SD表示。*;P < 0.05, ns;不显著。

AZE不影响Na的转运速率+/ K+- atp酶或NKCC1

碳酸酐酶的aze依赖性抑制间接抑制HCO3.转运体通过减少可利用底物,并且很可能通过影响位于脑脊液分泌脉络丛上皮两侧的一些转运机制来影响脑脊液分泌[35]。然而,AZE可能间接影响其他脉络膜运输机制,例如其对Na的作用+/ K+atp酶(14]。为了确定aze介导的其他关键脑脊液分泌转运蛋白转运率的降低,我们进行了体外放射性86Rb+外排和内流分析,作为NKCC1和Na活性的功能性读出+/ K+腺苷三磷酸酶。NKCC1活性测定为86Rb+(作为运送的K的同系物)+),对NKCC1抑制剂布美他尼敏感(图2)。6一个)。86Rb+布美他尼可使流出速率常数降低约50%(0.33±0.05和0.17±0.02 min)−1,各n = 6, P < 0.001,图2。6A, B).暴露于AZE不影响86Rb+排出率(对照组0.32±0.04 min,对照组0.34±0.05 min)−1在AZE中,各n = 6, P = 0.8,图2。6C, D)+/ K+-三磷酸腺苷酶活性监测为瓦阿因敏感的内流86Rb+.选择性Na的应用+/ K+- atp酶抑制剂瓦巴因使内流率降低70%(对照组为2772±1228 cpm,瓦巴因为794±530 cpm,各n = 6, P < 0.01),图。6E),而AZE没有改变摄取速率(对照2141±291 cpm和AZE组2168±883 cpm,各n = 6, P = 0.9,图。6F)。这些数据表明,aze介导的脑脊液分泌率的降低不是通过间接调节NKCC1或Na发生的+/ K+- atp酶,而是通过各种HCO3.转运蛋白位于脉络膜丛上皮。

图6
图6

AZE对选定的关键CSF分泌转运蛋白活性的影响。86Rb+外排率(NKCC1活性的读数)在用20µM布美他尼(一个)或200µM AZE (C)。采用线性回归分析定量测定布美他尼(B)及AZE (D)。86Rb+吸收速率(读出Na)+/ K+-三磷酸腺苷酶活性)以每分钟计数(cpm)表示,用2mm瓦巴因(E),用200µM AZE (F)。Na+暴露于200µM AZE或对照溶液时,SBFI染料的敏感迹如G,并被量化H(CTRL: -0.7±3.0%,AZE: 1.2±3.7%,n = 6, P = 0.34)。所有实验均在6只动物(n = 6)分离的脉络膜丛上进行,采用非配对t检验评估显著性。CTRL - control, AZE -乙酰唑胺,BUM -布美他尼,OUA -瓦巴因。数据以mean±SD表示。* *;P < 0.01, ***;P < 0.001, ns;不重要

露出脉络膜[钠+急性隔离AZE治疗后的动态体外脉络膜丛组织满载Na+-灵敏的荧光染料SBFI,并通过大视场SBFI成像监测。在AZE暴露期间,SBFI信号保持稳定(图2)。6G, H),表明[Na+在AZE的抑制作用中保持不受干扰,这与[Na+暴露于NKCC1和Na抑制剂后观察到的升高+/ K+atp酶(58]。这些数据支持了NKCC1和Na+/ K+- atp酶活性在AZE存在时不间断发生。值得注意的是,aze介导的脑脊液分泌率降低没有伴随[Na]的变化+可以通过抑制不同的HCO3.位于脉络膜丛上皮膜上的转运蛋白。

AZE不降低碳酸酐酶或与脑脊液分泌相关的关键转运蛋白的脉络膜表达

为了评估大鼠脉络膜丛中碳酸酐酶的表达,并评估慢性AZE治疗是否会引起与脑脊液分泌相关的脉络膜丛功能特性的变化,我们对每天一次接受AZE(或对照溶液)治疗7天的动物的脉络膜丛进行了RNAseq分析。在大鼠脉络膜丛中表达了13种不同的CA亚型,其中CA2的表达比随后的CA14高出近一个数量级(表1)1)。大鼠脉络膜丛碳酸酐酶同工型转录物与小鼠的比较[j]。64]和人的[63]脉络膜丛的研究结果显示,在所有3种物种中均检测到7种中至高水平(CA2, CA14, CA12, CA11, CA13, CA5B, CA3按丰度排序),这表明它们在组织中的功能重要性。CA4在大鼠和人脉络膜丛中均检测到,而CA6、CA9两种亚型仅在大鼠脉络膜丛中检测到。在大鼠脉络膜丛中,CA1、CA7、CA8三个亚型低于可靠检测水平。慢性AZE治疗没有引起脉络膜CAs的普遍下调,尽管CA4丰度降低到大约一半。相反,是补偿性的海拔高度编码CA9和CA12的转录本,以及两个关键的脉络膜转运机制Na+/ K+- atp酶和NBCe2(表2)。因此,慢性暴露于AZE似乎不会提供脉络膜CSF分泌装置的持续减少。

表1对照大鼠脉络膜丛中碳酸酐酶表达水平(每天1次,连续7天)与小鼠RNAseq数据的比较[63]和源自humans [62
表2表达水平、折叠变化(Log2对照液(CTRL)和100 mg ml处理后大鼠脉络膜丛主要转运蛋白、通道和碳酸酐酶的百分比变化−1AZE订单为7天(AZE),以每百万副本(TPM)为单位。碳酸酐酶的控制值见表1

慢性暴露于AZE不会对脑含水量或脑脊液分泌率产生长期影响

很明显,急性摄入AZE会降低ICP,至少部分原因是AZE介导的脑脊液分泌率降低。然而,在临床环境中有限的疗效需要评估AZE对慢性摄入的影响。为了确定长期暴露于AZE是否会改变脑脊液动力学,实验大鼠每天用AZE(或对照溶液)治疗一次,持续7天。末次处理后24 h脑含水量保持不变(对照组3.67±0.06 ml g)−1对照组动物干脑重为3.69±0.03 ml g−1AZE处理动物的干脑重,每种动物n = 5, P = 0.5,图3。7A)。通过脑室-池灌注试验,在治疗方案完成后的第二天获得相似的CSF分泌率,强调了慢性暴露于AZE后未受干扰的流体动力学的概念[59](5.4±0.7µl min)−1(4.7±1.3µl min)−1,各n = 4, P = 0.4,图2。7因此,慢性给药AZE(每天一次)似乎不会导致持续(24小时)脑液含量或其分泌减少。

图7
图7

AZE对脑含水量及脑脊液分泌率的影响。一个脑含水量以ml g表示−11 ×日给药100 mg kg后干重(每组n = 5, P = 0.5,未配对t检验)−1注射AZE(或对照溶液)7天,最后一次给药后24小时测量。数字B显示了对照组和AZE组的平均葡聚糖染料稀释度随时间的变化。虚线框表示计算脑脊液分泌率的时间段,这20分钟的平均值表示为C(每组n = 4, P = 0.4,未配对t检验)。CTRL - control, AZE -乙酰唑胺。数据以mean±SD表示。n,不显著。

长期服用AZE对ICP有短期影响

为了监测AZE治疗对清醒和自由活动大鼠的生理影响与时间的关系,我们采用Kaha遥测双压力变送器同时监测AZE治疗期间的ICP和MAP。植入该装置后,颅内压从术后第1天的6.0±2.1 mmHg降至术后10天的3.5±1.0 mmHg左右,n = 8(图8)。8A),心率模拟的模式(从413±21 bpm到338±25 bpm, n = 8,图。8B)。MAP在恢复期间是稳定的(术后91±9 mmHg,第10天为94±5 mmHg, n = 8,图。8C),但直到术后7天才可见昼夜振荡,证实在收集生理数据之前至少需要7天的恢复期。

图8
图8

在AZE治疗前和治疗期间自由活动清醒大鼠ICP的遥测测量。顶板表示植入遥测装置后的恢复期,显示ICP的每日波动(一个),地图(B)和心率(C)。D开始治疗前3天(72小时)的平均ICP (ICP)CTRL= 3.9±0.7 mmHg, ICPAZE= 3.7±1.1毫米汞柱,n = 4,未配对t检验,P = 0.8)。归一化为治疗开始前平均24小时ICP(基线)的ICP变化百分比见E每天1次,每次100毫克公斤−1AZE或控制溶液。最低1小时平均ICP值(在AZE或对照溶液注入后的前7小时内)与基线ICP的差值见F(每组n = 4, P < 0.001,未配对t检验)。给药后24小时内的ICP波动表示为G(每组n = 4,采用Bonferroni事后分析的双因素方差分析),其中计算对照组和AZE治疗大鼠在6天治疗期间每2小时的平均ICP。给药后2 ~ 3 h静脉注射IRDye 800 CW羧酸染料,染色流量(H)及费率(nCTRL= 6, nAZE= 5, P < 0.01,未配对t检验)作为评价脑脊液分泌率的指标。以100 mg kg 3× d处理效果最佳−1面板中显示了5天的AZE或控制溶液J(每组n = 4, P < 0.05,未配对t检验)。ΔICP计算为每次(14)AZE或对照溶液p.o.交付后7小时内基线ICP与最小1小时平均ICP之间的差值。在K,在3天治疗期间的ICP波动,归一化到基线ICP。计算基线期6点、13点和20点(p.o.给药前1小时)的平均ICP,并与100 mg kg 3× d治疗期间同一时间点的平均ICP进行比较−1AZE (l, n = 12, P < 0.01,配对t检验)或对照溶液(, n = 12, P = 0.7,配对t检验)。ICP -颅内压,MAP -平均动脉压,HR -心率,CTRL -控制,AZE -乙酰唑胺,BSL -基线,a.u -任意单位。数据以mean±SD表示。*;P < 0.05, **;P < 0.01, ***;P < 0.001, ns;不显著。

恢复期结束时,实验大鼠72 h平均颅内压为3.8±0.9 mmHg, n = 8,两组间差异无统计学意义,P = 0.8(图2)。8D)。治疗期开始于口服AZE(或对照液),每24 h重复一次,连续6天,期间连续监测ICP和MAP。在对照大鼠中观察到的ICP模式与治疗方案开始前的大鼠相似(附加文件)1:图S1 A)。ICP随昼夜周期波动,但与对照大鼠相比,暴露于AZE的大鼠的ICP偏转更多(图S1 A)。8E)与对照组(-0.5±0.2 mmHg, n = 4, P < 0.001)相比,aze诱导的颅内压降低(-1.6±0.1 mmHg, n = 4)明显更高。8F. aze介导的icp减少持续约10小时后处理(图2)。8G),之后AZE处理大鼠的ICP与对照大鼠相当(治疗后10-12 h AZE处理大鼠的ICP为基线的111±6%,n = 4,为基线的116±6%,n = 4, P = 0.2)。在随后的几天中,观察到相同的模式(图2)。8G)。

为了确定急性治疗动物实验方案中观察到的aze介导的ICP偏转是否源于脑脊液分泌率的降低,我们使用荧光成像技术测量了脑脊液分泌率。5A.这种快速方案使我们能够在给药6剂AZE(或对照溶液)的最后1剂后2-3小时精确测定脑脊液分泌率。与对照组相比,脑脊液分泌率降低了50%(0.18±0.04 a.u. min)−1, n = 6, 0.09±0.04 a.u. min−1, n = 5, P < 0.01,图8这些数据支持aze介导的脑脊液分泌率的降低是其对ICP的调节作用的基础。

aze介导的ICP降低没有反映在MAP或心率的变化中。实验大鼠MAP为94±5 mmHg (n = 8),另附文件1:图S1B),并且在整个实验期间,AZE组和对照组之间无法区分(附加文件)1:图S1C)。心率也是如此,基线心率为343±26 bpm (n = 8),附加文件1:图1D),无aze介导对该参数的影响(附加文件1图S1E)。这些数据表明AZE在清醒和自由活动的大鼠中以独立于心血管作用的方式有效降低ICP。

为了确定频繁给药方案是否能提供持续降低ICP以达到这种药物治疗的临床疗效,大鼠每天给药3次,间隔7-7-10小时。aze介导的最大颅内压降低与单日剂量相似(相比之下,3天治疗- 1.7±0.4 mmHg)。8J)为−1.6±0.1 mmHg(图1)。8F),每组n = 4, P = 0.8)。然而,每日3次的剂量提供了持续的ICP下降(图2)。8K),在任何时候都没有达到基线水平(比较4.8±1.1 mmHg基线ICP与3.9±1.2 mmHg ICP在任何下一个AZE治疗之前,n = 12(3个不同时间点的4个生物重复),图0.01。8l)相比之下,对照组的ICP在整个实验过程中保持在基线水平(对照液每次治疗前的ICP基线值为5.8±1.3 mmHg和5.8±1.0 mmHg,每组n = 12, P = 0.7)。因此,白天定期给药AZE可确保实验大鼠的ICP持续降低。

讨论

在这里,我们提供了AZE在体内啮齿动物模型中降低ICP的能力的证据,并展示了这种结果是由AZE引起的直接作用于脑脊液分泌机制,而不是通过调节其他生理过程间接影响脑脊液分泌我们证明AZE降低颅内压和减少脑脊液分泌速率的能力是短暂的,从而证实了在临床环境中频繁给药的必要性。

AZE已被证明可降低不同物种的脑脊液分泌率[1617181920.21222324252627282930.31],无论其给药途径(静脉注射或静脉注射),因为AZE可以穿过细胞膜到达脉络膜碳酸酐酶。本研究证实AZE降低脑脊液分泌率的程度相似(40%),无论给药是静脉注射、静脉注射还是口服。AZE介导的脑脊液分泌减少不是通过影响Na的转运活性发生的+/ K+- atp酶或NKCC1,它们都参与脑脊液分泌[212259],尽管我们不能排除未受干扰的人86Rb+外排可能掩盖了与aze介导的K升高完全匹配的NKCC1活性的降低+通道的活动。我们认为AZE很可能间接作用于各种HCO3.定位于脉络膜丛并与脑脊液分泌有关的转运蛋白[35]。AZE曾被认为促进Na的表达增加+/ K+-大鼠atp酶和AQP1 [14],然而,如果有的话,这应该会导致脑脊液分泌升高。然而,这样的结果可能是由于研究中使用的AZE浓度过高造成的。虽然AZE被认为可以抑制AQP1 [6970],详细的研究表明,在通常采用的AZE浓度下,AZE对aqp1介导的水运没有直接影响[71]。然而,脑脊液分泌率的这种调节是否直接反映在颅内压和/或脑室容积的变化中,尚不清楚。后两个参数不一定同时出现,如特发性颅内高压,其颅内压升高但脑室增大[12],与之相反的是正常压力脑积水,脑室增大,但颅内压没有升高或只有轻微升高[72]。这些疾病的病因尚不完全清楚,但AZE治疗仍可用于治疗这些患者群体的症状[1273],尽管这种方法受到了一些临床试验的质疑[89]。

我们在这里证明,健康实验大鼠给予AZE导致其ICP降低40%,无论给药方式(静脉注射、体外注射或灌胃),以及动物是否处于麻醉状态或自由活动。这一发现与早期证实AZE降低ICP疗效的研究一致[1314],但对比了一项对镇静大鼠的研究,在控制溶液渗透压的情况下,在AZE给药后,无论是s.c还是p.o(在Nutella中),都没有观察到ICP的差异[15]。AZE给药的途径和/或实验过程中缺乏机械通气可能导致观察结果的差异。健康大鼠ICP降低40%相当于ΔICP < 2 mmHg,目前尚不清楚AZE治疗在多大程度上能确保ICP升高动物模型中实验性造成的ICP升高的显著降低。值得注意的是,在出血性中风的动物模型中,AZE被证明可以防止ICP峰值,而不会降低平均ICP [74],而在脑出血大鼠模型中,AZE降低了脑含水量并改善了功能预后[75]。

在目前的研究中,我们证明了清醒大鼠在p.o. AZE给药后≥2小时,ICP显著下降,这与在患者中观察到的效果相当[76]。在这个确切的时间点测量脑脊液分泌显示了潜在的脑脊液分泌的强烈减少,这与麻醉大鼠急性给药AZE(静脉注射或静脉注射)时观察到的结果一致。遥测ICP测量为AZE的作用模式提供了重要的见解,可用于设计临床治疗方案。术后7天清醒大鼠颅内压测量可靠、稳定。每日单剂量AZE,相当于临床使用的人体单剂量1g [1215],有效降低ICP。然而,ICP在治疗后10-12小时内恢复到基线水平。重复单次每日剂量AZE缺乏长期效应反映在两个实验组中相同的脑含水量和最终给药后一天的脑脊液分泌率未受干扰,并且编码碳酸酐酶或编码参与脑脊液分泌的转运蛋白的脉络膜转录物缺乏下调。每天3次而不是每天1次给予AZE,导致整个24小时周期内ICP显著下降,尽管停止治疗后,ICP恢复到基线水平。这一发现表明,频繁给药和严格的患者依从性对于通过AZE治疗有效缓解ICP升高的症状至关重要。

aze介导的ICP降低似乎是脑脊液分泌减少的直接结果。脑脊液分泌的减少可通过抑制脉络膜丛中的碳酸酐酶直接发生。我们在大鼠脉络膜丛中检测到CA亚型2、14、4、12、11、6、13、9、5B、3(按表达水平顺序)的表达(图2)。9)。其中大多数在小鼠和人类脉络膜丛的转录水平上也被检测到,尽管在未来治疗涉及ICP升高的病理时,针对特定的CA需要考虑一些物种差异(例如CA6, CA9)。其中一些脉络膜CA亚型(CA2, CA3, CA9, CA12, CA14)已在蛋白水平上得到证实[4243444546],但它们对脑脊液分泌的个体定量贡献仍未得到解决。虽然我们没有检测到AZE处理后其中一些CAs的表达水平发生变化,但在蛋白质水平或从膜上插入/消除方面仍可能存在差异。然而,aze介导的ICP降低可以通过影响体内其他组织和细胞类型中的碳酸酐酶间接发生。通过这种方式,AZE被认为可以影响血压[4849],可以减少脉络膜丛的血流量[2377],导致脑脊液分泌率下降[50]。尽管aze诱导的颅内压明显降低,但我们没有发现aze介导的MAP下降,无论是给麻醉大鼠静脉注射或静脉注射,还是给自由活动的大鼠静脉注射,并对它们的MAP进行遥测监测。AZE可降低血[HCO]3.],这本身就会影响脉络膜HCO的运输速率3.支持脑脊液分泌的转运蛋白[40],从而间接降低脑脊液的分泌。aze介导的[HCO3.然而,在静脉注射AZE或在静脉注射AZE之前对实验大鼠进行功能性肾切除术后,这种调节被消除,而在这两种实验范式中,ICP的降低都是持续的。因此,AZE通过降低脑脊液分泌率来降低ICP的能力独立于其对血压和肾功能的潜在影响。

图9
图9

脉络膜丛上皮(CPE)细胞中碳酸酐酶和转运蛋白的示意图。CA12在脉络膜丛的基底外侧表达[42], CA4和CA14一般是膜结合的[4],但它们在脉络膜丛细胞中的确切位置(管腔或基底外侧)仍未确定。CA2和CA13都是细胞质[445],而CA5B则存在于线粒体[79]。未显示CA6和CA9,它们在小鼠和人脉络膜丛中不存在(表2)1), CA3,对AZE不敏感[44]和可能具有催化作用的CA11 [4]。大鼠脉络膜丛CA异构体1、7、8、10和15低于检测水平(表1)1)。参与脑脊液分泌的关键转运体NKCC1和Na/ k - atp酶不受AZE治疗的影响。介导aze诱导的脑脊液分泌减少的主要候选物质是碳酸氢盐转运体:在基底外侧膜表达的AE2和NBCE/NBCn2以及在管腔膜表达的NBCe2。球体面积表示转录表达水平

通过静脉注射AZE引起ICP的初始峰值,随后逐渐下降。这个峰值反映在呼出的CO的减少上2因此血液pCO升高2.pCO的突然增加2可能引起颅内血管舒张[78],这可能导致观察到的ICP峰值,类似于从100% O切换时观察到的峰值2吸入30% CO2在实验猫[27]。为了支持其血管起源,升高的pCO2通过灌胃方式给药AZE的实验大鼠没有出现ICP峰。aze介导的血pCO升高2系统应用后,在整个实验期间保持。生物体通常通过过度通气来纠正pCO2海拔高度。机械过度通气使实验大鼠血液pCO降低2与“正常”通气参数的大鼠相比,对照组大鼠和暴露于AZE的大鼠都有明显的差异。然而,aze诱导的颅内压降低保持不变,甚至稍微更明显。后一项发现提示AZE联合过度通气有时在临床上用于治疗颅内压升高[54],可以作为管理ICP的补充工具。然而,这种加性效应可能是由次要机制引起的,如pCO2-介导的脑血流减少[23],因为脑脊液分泌在“正常”通气和过度通气的动物之间没有差异[29]。综上所述,aze介导的ICP降低不是由pCO增加引起的2

综上所述,AZE通过降低脑脊液分泌率来降低健康大鼠的ICP。AZE以直接的方式作用于脑脊液分泌机制,最有可能是针对脉络膜碳酸酐酶。这些酶调节底物对HCO的可用性3.在脉络膜丛中高度表达的转运蛋白,被认为是该组织中脑脊液分泌的关键贡献者[354041]。像AZE这样的非选择性CA抑制剂会影响体内所有其他组织和细胞类型中的碳酸酐酶,这会导致使用该抑制剂时观察到的许多令人不快的副作用[10]。然而,这些作用似乎并不影响脑脊液分泌率或ICP。这些发现提供了未来选择性靶向脉络膜碳酸酐酶的希望,以寻找一种药理学方法来降低患有这种特征的任何病理患者的ICP升高。

数据可用性

本研究中使用的数据集可应通讯作者的合理要求向其提供。

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下载参考

致谢

我们感谢哥本哈根大学卫生与医学科学学院神经科学系实验室经理Trine Lind Devantier提供的技术援助。我们还要感谢哥本哈根大学卫生与医学科学学院实验医学系的Maria Mathilde Haugaard和Karsten Pharao Hammelev兽医为优化生存手术程序所做的贡献。

资金

该研究由诺和诺德基金会联合资助(NNF17OC0024718资助NM)、Brødrende Hartmann资助(资助NM)、Lundbeck基金会(资助NM的R276-2018-403和资助TLTB的R303-2018-3005)、嘉士伯基金会(资助NM)、Læge Sofus Friis奖学金(资助NM)、DFG (FOR2795, Ro2327/13-1;退休研究中心)。

作者信息

作者及单位

作者

贡献

研究构思与设计:DB, NM, CRR,实验与数据分析:DB, EKO, JHW, TLTB, EC, SNA, NJG,手稿起草:DB, NM。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

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伦理批准并同意参与

动物实验由丹麦动物实验监察局批准(许可证号:2016-10-01 -00944和2018-15-01 -01595)或塞尔多夫海因里希·海涅大学动物护理和使用设施的动物福利办公室(机构法案号:O52/05)。

发表同意书

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相互竞争的利益

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额外的信息

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附加文件1。

血气分析和遥测ICP测量。

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Barbuskaite, D., Oernbo, e.k., Wardman, J.H.et al。乙酰唑胺通过作用于脑脊液分泌器直接调节颅内压。beplay靠谱流体屏障19, 53(2022)。https://doi.org/10.1186/s12987-022-00348-6

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关键字

  • 脑脊液分泌
  • ICP
  • 脑积水
  • 颅内高压症
  • 脉络丛
  • HCO3.转运蛋白