聚焦超声介导的血脑屏障破坏后炎症反应的新见解

背景

尽管FUS-BBBD具有巨大的潜力，但FUS-BBBD是否作为神经炎症的诱导因子仍存在争议，FUS-BBBD触发炎症过程后的生物学反应尚不清楚。本研究的目的是在综合安全性评估的基础上探讨FUS水平的安全窗口。

方法

在小鼠脑丘脑区分别施加0.25 MPa和0.42 MPa两种不同超声参数。通过动态磁共振造影(DCE-MRI)和空化监测验证血脑屏障打开的有效性。转录组分析是为了研究fus介导的血脑屏障以时间依赖的方式打开后两种血脑屏障条件的分子反应。采用组织学分析评价FUS-BBBD诱导的组织损伤、神经元变性和胶质细胞活化情况。

结果

BBBD，用K_反式， 0.42 mpa处理组比0.25 mpa处理组高约3倍。0.25 mpa处理组组织/细胞损伤最小，而0.42 mpa处理组根据BBBD程度可观察到微出血和神经元变性损伤。转录组分析显示，0.42 MPa组炎症反应或NF-κB通路相关基因的表达水平呈时间依赖性的高度动态变化，而0.25 MPa组则没有变化。有趣的是，虽然0.42 MPa通过神经胶质活化诱导神经炎症，但a2型星形胶质细胞的表达显示出神经保护作用。

结论

我们的研究结果表明，明确定义0.25 MPa的BBBD参数可以确保安全性，而不会造成细胞/组织损伤或脑内无菌炎症反应。此外，0.42 MPa过大的超声参数可以通过神经胶质激活诱导无菌炎症反应，这表明可能通过a2型反应性星形胶质细胞导致组织修复，以达到脑微环境的稳态。

聚焦超声(FUS)结合微泡(MBs)是一种很有前途的医疗工具，可以帮助治疗药物穿透暂时破坏的血脑屏障(BBB)治疗各种脑部疾病[1]．FUS可以通过在高度特化的脉管系统内的mb振荡诱导机械应力，并在所需的脑区破坏血脑屏障[2]．FUS-BBBD破坏(FUS-BBBD)技术已经在各种实验模型中得到验证和优化，从啮齿类动物[3.，4，5]到非人灵长类动物(NHPs) [6，7]．目前，临床试验正在进行中，包括阿尔茨海默病(AD) (NCT03739905, NCT03671889, NCT04118764) [8]，胶质母细胞瘤(NCT04063514) [9]和帕金森病(PD) (NCT04692116) [10]．最近，基于关键临床试验的数据，美国食品和药物管理局(fda)于2021年批准了临床FUS设备，适用于有活动能力、僵硬或运动障碍症状的晚期PD患者[10]．

尽管FUS-BBBD具有强大的功能，但其潜在的有害影响预计存在安全问题。多项研究表明，FUS-BBBD可根据暴露强度诱导脑出血、短暂性水肿、细胞死亡和神经胶质活化[11，12，13]．使用FUS-BBBD系统诱导血管通透性时应考虑安全性，以尽量减少脑损伤的风险。FUS参数是改变FUS- bbbd生物学反应的主要因素。28千赫至8兆赫的声波频率已被用来增加血脑屏障的渗透率[14，15]．既往研究表明，超声强度可影响BBBD的程度，组织出血分级是超声压力分级的依据[16]．一些报道表明，诸如脉冲长度、脉冲重复频率(PRF)和超声持续时间等因素也会影响超声的生物学结果[17，18，19]．必须考虑的是，超声参数应该设计得很好，以平衡血脑屏障通透性的增强，并对组织损伤有可接受的影响。

其次，mb在FUS-BBBD的安全性中起着至关重要的作用。即使使用相同的FUS-BBBD方案，MB反应也可能引起意想不到的反应，这取决于MB的剂量、大小分布和外壳组成[20.，21，22]．超声过程中MB振荡的声发射可以用来评估MB在体内的活性。在足够的压力下，稳定振荡的mb产生的稳定空化可以诱导血脑屏障的通透性，对靶部位的负面影响最小。同时，在超声波进一步增加的情况下，mb的坍缩会产生惯性空化。近年来，声空化监测系统被认为是BBB开口新的可靠安全指标[23]．一些研究报道了被动空化探测器(PCD)获得的声发射与FUS-BBBD治疗结果之间的相关性[12，24]．该控制系统将声压维持在阈值内，使BBBD和药物递送有效，而不会对啮齿动物造成明显的组织损伤[25，26]及NHPs [27]．

FUS-BBBD的主要安全性问题是bbb开放区域的炎症反应。最近的一项研究表明，FUS-BBBD通过增加促炎细胞因子、损伤相关分子模式(DAMPs)和细胞粘附分子来改变实质微环境[28]．这些急性炎症分子诱导无菌炎症，引起组织损伤和修复[16，29]．特别是，FUS-BBBD在基于先天/适应性免疫反应的AD模型中清除淀粉样斑块的潜力已经得到证实[30.，31]．最近的转录组学研究表明，FUS介导的炎症取决于微泡剂量、空化和FUS参数[26，32，33]．此外，Mathew等人认为麻醉药的多样性影响FUS-BBBD后脑组织的潜在反应性[34]．炎症介导的FUS- bbbd是否有害仍然存在争议，对炎症介导的生物学反应的机制和FUS实验参数的贡献的了解是有限的。

小胶质细胞和星形胶质细胞作为中枢神经系统(CNS)内事件的传感器，参与神经炎症的进展[35]．基于神经炎症和缺血，小胶质细胞在激活后分化为两种不同的表型，称为“M1”和“M2”[36，37]．这个术语也与“A1”和“A2”反应性星形胶质细胞相似[38，39]．M1-和a1样胶质细胞的功能表型以炎症反应分子上调为特征，可能具有有害功能。相反，M2和A2胶质细胞上调免疫抑制和神经保护分子的表达，提示其有益和恢复功能。与此一致的是，有报道称a2反应性星形胶质细胞通过上调许多神经营养因子发挥有益作用，导致中枢神经系统损伤后的恢复和修复[40，41，42，43]．尽管最近的研究报道了神经胶质细胞对FUS-BBBD的反应[13，28，44]，神经胶质细胞极化与超声介导的机械生物效应之间的关系尚不清楚。在这项研究中，我们认为FUS-BBBD诱导神经胶质细胞亚型的改变。

FUS-BBBD的安全性受多种因素的影响。为了更好地了解FUS应用后的安全窗口，有必要同时评估常用的评估方法(如MR成像、组织学和空化监测)和分子生物学反应性(如转录组筛选)。因此，本研究旨在通过转录组分析评估两种不同声压后血脑屏障通透性和空化活性的综合安全性。此外，为了探索FUS-BBBD后稳态反应的影响，根据其激活的胶质细胞亚型进行转录组分析。这项研究为FUS-BBBD后大脑炎症反应提供了新的见解。

动物

所有实验均按照大邱-庆北医疗革新财团(DGMIF-19100701-00)动物保护和使用委员会(IACUC)批准的程序进行。8周大的雄性癌症研究所(ICR)小鼠(韩国城南的Orient Bio Inc.)使用Zoletil 25 mg/kg (Virbac, Carros，法国)和Rompun (4.6 mg/kg;拜耳，勒沃库森，德国)，在整个实验过程中不断监测肌肉注射。90只ICR小鼠随机分为5组:血脑屏障通透性表征和被动空化检测(n = 12)、转录组和qRT-PCR分析(n = 24)、western blot分析(n = 24)、免疫荧光分析(n = 24)、苏木精和伊红(H&E)组织病理学(n = 6)。

血脑屏障通透性的表征

临床前MRgFUS系统(RK-100, FUS Instrument, Toronto, Canada)用于BBB破坏，如前所述[45]．简而言之，该装置包括一个气背式、单元件、球面弯曲的压电换能器(FUS Instrument, Toronto, Canada)，其直径为75 mm，曲率半径为60 mm，谐振频率为1.1 MHz。使用声强测量系统(AIMS III, ONDA Sunnyvale, CA, USA)和水听器(HGL-400, ONDA)测量自由水焦点区域的超声压力分布。换能器浸泡在装满脱气水的水箱中。实验动物以仰卧位放置在核磁共振兼容的动物床上，如附加文件所示1:图S1然后使用9.4 T临床前MRI (BioSpec 94/20 USR, Bruker, Ettlingen, Germany)进行聚焦超声系统的图像引导和血脑屏障通透性表征。信号传输采用内径为86毫米的射频线圈。采用二维重聚焦回波快速采集(RARE)脉冲序列采集t2加权图像，将t2加权图像作为图像导向，参数设置如附加文件所述1表S8。MRgFUS应用于整个丘脑区域的四个靶点进行转录组/免疫印迹分析(附加文件)1(图S2a)或一个半球丘脑区域的两个靶点进行免疫组织化学分析(附加文件)1:图S2b)。在MR图像的基础上，从整个大脑中分离出唯一的fus靶向丘脑区域，并进一步进行基于分子的实验。在应用FUS之前，激活微泡(0.02 mL/kg, Definity, Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA, USA)在生理盐水中稀释1:50，使用自动注射泵(Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)通过尾静脉导管注射。随后，为了破坏血脑屏障，在自由水条件下，以1 Hz脉冲重复频率(PRF)为120秒(占空比为1%)，以0.25或0.42 MPa的声峰值压力向大鼠大脑丘脑区传递10 ms脉冲超声。BBB中断后，重新聚焦回声可变重复时间(RARE VTR)和动态对比增强(DCE)-MRI的快速采集[45]或t1加权MR图像，参数设置如附加文件所述1表S8通过尾静脉注射0.02 ml/kg钆基造影剂(Dotarem, Guerbet, Roissy, France)以确认血脑屏障通透性。血脑屏障通透性(K_反式)是根据Patlak模型[46使用DCE-MRI图像。为了进一步的实验，在指定的时间点经心向大脑灌注0.9% NaCl，然后用4%多聚甲醛(PFA)固定或快速冷冻。

被动空化探测

声空化是通过被动空化探测器(PCD;V306，中心频率:2.25 MHz, OLYMPUS, MA, USA)插入换能器中心用于超声。采集到的信号被传输到MRgFUS系统中的DAQ板(ATS460, AlazarTech, Quebec, Canada)，并在20 MHz, 14 bit, 125 MS/s下进行采样。将BBBD期间记录的发射信号归一化为相同位置无MB的基信号。空化剂量是根据超声过程中监测到的发射信号时间功率变化曲线下的积分面积计算的。计算了表征空化行为的三个空化参数:稳定空化剂量与谐波(SCD)_h)，稳定的亚谐波和超谐波空化剂量(SCD)_u)，宽带发射惯性空化剂量(ICD) [47，48]．稳定谐波分量被识别为每个谐波(n)周围的峰值f_c， n = 1,2,3…f_c= 1.1 MHz)和亚/超谐波(nf_c/2, n = 1,3,5…)频率。

cDNA文库构建及RNA测序

为了评估基因表达水平，在BBBD后1、6、12、24和48 h处死小鼠(每个时间点n = 2)。假对照小鼠接受MB和对照剂治疗，但不进行FUS超声检查(n = 2)。将组织快速冷冻在液氮中，保存在- 80°C，直到RNA分离。根据制造商的说明，组织(100-120 mg)使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)进行均质和分离。使用NanoDrop™2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)测定总RNA浓度和质量。随后，总RNA用于测序或实时qPCR分析。cDNA文库采用Illumina TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 (Illumina Inc.， San Diego, CA, USA)，总RNA浓度为1 μg。接下来，使用Illumina HiSeq进行配对端测序^™4000测序仪，根据制造商的说明，产生100 bp的对端读数。

转录组组装和分析

使用HISAT2 version 2.1.0将Reads映射到基因组DNA参考(UCSC mm10) [49]和Bowtie2 2.3.4.1 [50]．随后，String Tie版本1.3.4d [51]被用来进行转录本组装与对齐的读取。每个单基因的转录水平由总映射读数确定，并标准化检测每千碱基外显子每百万片段映射(FPKMs)的片段数。所有样本中包含FPKM值为0的基因的Reads被排除在分析之外。对于差异表达基因(DEGs)分析，计算log2 (FPKM + 1)的值进行分位数归一化。基因本体(GO)富集分析使用g:Profiler工具(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/)为表达水平差异显著的基因列表。对于功能注释，基于KEGG通路的途径富集分析(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)，并将其可视化为热图。以阈值评估原始数据的统计学显著性P< 0.05，折间变化采用独立t以及。

实时定量反转录PCR分析

基于转录组序列，利用Primer 3软件设计PCR引物。4.0;http://primer3.ut.ee)。使用Omniscript RT试剂盒(Qiagen)，根据制造商的说明，从2 μg的总RNA合成cDNA。GAPDH作为内部控制。采用Power SYBR™Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific)在Applied Biosystems 7500 Real-time PCR Instrument System (Thermo Fisher Scientific)上进行实时定量PCR。引物序列在附加文件中列出1表S7。实时PCR程序为95°C 2 min，然后进行40-45个循环，95°C 15 s, 60°C 15 s, 72°C 20 s。在循环结束时进行熔化曲线分析，以确保使用应用生物系统ABI 7500软件(版本。2.3;赛默飞世尔科技公司)(附加文件1:图S6)。目的基因与其内务基因(GAPDH)用2^−ΔΔCt方法(52]．实验描述和数据呈现遵循定量PCR实验发表的最少信息指南[53]．

Western blot分析

在BBBD后1、6、12、24和48 h (n = 2，每个时间点)对脑组织分离蛋白进行Western blot分析。脑组织在含有蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)的RIPA裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific)中裂解。使用Pierce™BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测定总蛋白浓度。等量的总蛋白被装载到12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，并转移到预活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)。在tris缓冲盐水(TBS)中用5%脱脂牛奶阻断PVDF膜;pH 7.4)，含0.1% Tween 20，室温下放置1小时。用兔抗p65 (Cell Signaling， #4764;1:1000)，兔抗磷酸化p65 (Cell Signaling， #3033;1:500)，兔抗κ b α (Cell Signaling， #4812;1:10 00)，小鼠抗磷酸化i- κ b α (Cell Signaling， #9246; 1:500), and rabbit anti-GAPDH (Cell Signaling, #2118; 1: 5000). Subsequently, the blots were incubated with HRP-conjugated secondary antibodies at 1: 3000 for 1 h at room temperature and developed using ECL Prime western blotting Detection Reagent (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Visualization and imaging of the blots were performed using a ChemiDoc MP imaging system (Bio-Rad).

免疫荧光分析

分别于BBBD后1 h、6 h、12 h、24 h和48 h处死小鼠(每个时间点n = 2)。用0.9% NaCl和4%甲醛经心灌注小鼠进行免疫荧光实验。提取的脑用4%甲醛在4℃下固定3天。使用振动刀片切片机(Leica VT1200S, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)将固定的脑切成30 μm的切片。用0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)在室温下渗透组织切片1小时。组织在含有10%正常山羊血清(Abcam, Cambridge, MA, USA)的阻断溶液中孵育2小时，然后与特异性一抗孵育过夜，包括兔抗iba‐1 (Wako, Osaka, Japan， #019-19741;1:250)和小鼠抗gfap (Sigma-Aldrich， #G3893;1:1000)。二抗包括Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG (Cell Signaling， #4413;1:10 00)， Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG (Cell Signaling， #4408; 1: 1000). The slides were mounted with a fluorescence mounting medium (Dako, Glostrup, Denmark).

组织病理学染色

为了评估组织损伤，超声后约4小时处死小鼠，并用苏木精和伊红(H&E)染色脑组织(n = 3) [29]．所有组织标本切除后用10%福尔马林固定3天，厚度为3mm，按标准程序包埋于石蜡中。每个组织制备厚度为6 μm的连续切片，并用苏木精和伊红染色试剂盒(VECTOR Laboratories, Burlingame, CA, USA)进行染色。为了观察超声作用下的神经元退化情况，在超声24小时后(n = 2)使用商业试剂盒(Biosensis, Thebarton, South Australia)进行FJC染色。简单地说，组织载玻片浸泡在10%氢氧化钠溶液(v/v)中进行渗透，然后在10%高锰酸钾溶液(v/v)中孵育以阻断。将20% FJC和20% DAPI (v/v)的混合物滴在组织载玻片上，室温孵育20分钟。将载玻片干燥，用DPX贴载介质(Sigma-Aldrich)盖上盖盖。

图像分析

免疫荧光和组织学染色的组织切片在20 ×magnification使用Axio扫描成像。Z1显微镜(卡尔蔡司，哥廷根，德国)。采集的图像使用Zen 2图像处理软件(蓝色版，卡尔蔡司)进行处理。为了量化FJC染色的免疫荧光强度，在高倍镜下(×100)选择与增强T1w MR图像轴面重叠的超声区域的20个roi，使用ImageJ软件(版本1.40;美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院)。

统计分析

采用SPSS软件(version 22.0, IBM Corp.， NY, USA)和GraphPad Prism软件(version 8.0, GraphPad, CA, USA)进行统计分析。所有数值均以mean±SD表示。采用双尾学生不配对法比较两组的均值t以及。采用Pearson相关系数评价RNA测序结果与qPCR结果的关系。统计学显著性设为P< 0.05。

mrgfus诱导BBBD的证实

在0.25和0.42 MPa声压下建立两种FUS实验条件，研究超声压力对血脑屏障通透程度的影响。Gd-DTPA给药后(6、12和18分钟)，t1加权MR图像中MR造影剂的信号增强证实BBBD(图2)。1a). 0.25 MPa组靶BBBD区MR相对信号强度升高至56.6±5.7%，0.42 MPa组升高至93.2±4.8%(图2)。1b)。

我们使用动态对比增强MRI (DCE-MRI)进一步研究FUS-BBB开口的通透性。1c).在0.42 MPa组K_反式值为0.06±0.022 min⁻¹， 0.25 MPa组，K_反式达到0.02±0.005 min的值⁻¹．的K_反式约为0.25 MPa组的3倍(P< 0.0001;双尾学生的t以及,无花果。1d).为了比较空化活度，从声发射光谱中获得了空化剂量(图2)。1e, f).含谐波的稳定空化剂量(SCD_h)信号明显大于稳定空化剂量的超谐波信号(SCD)_u)或惯性空化剂量(ICD)(图2)。1e).当声压增加到0.42 MPa时，SCD_u增加，并且与0.25 MPa组相比，观察到明显的宽带发射ICD(图2)。1f).上述结果表明，0.42 MPa声压条件比0.25 MPa声压条件下通过增加MB诱导血脑屏障更具渗透性。

接下来，我们根据BBBD的程度进行组织学评估，观察组织/神经元的损伤情况(图2)。1胃肠道)。0.25 MPa FUS作用下的组织未见明显的红细胞外渗(图2)。1g;额外的文件1:图S3a)或fjc阳性神经变性(图S3a)。1h;额外的文件1:图S3c)。相比之下，在0.42 MPa下接受FUS治疗的组织出现了红细胞外渗和微空泡化区域(图2)。1g;额外的文件1:图S3b)，以及fjc阳性神经变性(图S3b)。1h;额外的文件1:图S3d)， FJC强度增加42倍(P< 0.0001;双侧学生t检验，图21i).我们的研究结果显示，0.25 MPa组BBBD充足，无组织学损伤，而0.42 MPa组BBBD过量，有组织/细胞损伤。

通过两个FUS-BBBD参数分析BBBD后的转录谱

考虑到两种声压诱导的不同组织反应，我们进行了转录组分析，通过两个FUS参数以时间依赖的方式获得了靶血脑屏障开放区域基因表达的全面剖面。对差异表达基因(deg)进行分层聚类分析，满足log2 (fold-change) > 2和P-value < 0.05，在总比较对中至少有一个(假对照)与1、6、12、24、48 h)。2a, b)。在0.25 MPa组中，在所有比较中，总共17403个转录本中鉴定出24个DEGs(0.14%)(图2)。2c;额外的文件1(表S1)，而在0.42 MPa组中，共鉴定出17570个转录本中的258个(1.47%)。2d;额外的文件1表2)。观察到转录组的差异，并且在FUS-BBBD后0.25 MPa组中，下调deg的表达模式主要以时间依赖性的方式呈现(图2)。2c)。相比之下，在0.42 MPa组中，随着时间的推移，deg的上调呈显著增加趋势(图2)。2d).这些结果表明，0.25 MPa条件对基因表达的影响弱于0.42 MPa条件，这意味着0.42 MPa条件可以诱导更复杂的转录调控。

两种FUS-BBBD条件下的基因本体(GO)分析

为了研究DEGs的所有分子功能，我们对0.25 MPa和0.42 MPa的FUS参数进行了氧化石墨烯功能分类。我们总结了氧化石墨烯三个领域的deg:生物过程、细胞成分和分子功能。所有结果按富集分数排序，各类别前10名结果如图所示。2练习。在0.25 MPa组的24℃中，“细胞群增殖”在“生物过程”域中表现出最显著的富集项(图2)。2e).在“分子功能”方面，与“RNA聚合酶II核心启动子序列特异性DNA结合”相关的基因最为富集(图2)。2f).“细胞成分”域无显著差异。258℃、0.42 MPa条件下，应力响应高度富集于“生物过程”范畴(图2)。2g)。在“细胞成分”区域，属于“细胞外区域”的基因高度富集(图2)。2h).“蛋白质结合”是“分子功能”本体中最富集的术语(图2)。2i). GO注释也通过比较5个两两组(sham controlvs。0.25 MPa和0.42 MPa)，得到10个富集程度最高的氧化石墨烯(另附文件)1:图S4，附加文件1: S5)。

DEGs的KEGG通路富集分析

为了进一步阐明所有deg在0.25和0.42 MPa BBBD条件下的生物学功能和关键通路，我们进行了KEGG通路富集分析(图2)。3.)。以FDR值< 0.05为截止值，在各组间鉴定出显著富集的通路。在本研究中，在0.25 MPa组中有24个deg标记属于12个KEGG通路，在0.42 MPa组中有258个deg标记属于103个KEGG通路。0.25 MPa组中10条最富集的通路如图所示。3.a.对每个高度呈现的图谱进行注释的最显著富集的KEGG途径是属于“有机系统”类别的“人类t细胞白血病病毒1感染”(图2)。3.a).在0.25 MPa条件下48 h，构建了前20条KEGG通路及其相关的8个下调基因的通路相互作用网络，如图所示。3.c.四个主要枢纽基因Pmaip1，Cdkn1a，”丛书,NFκbia与几条不同的路径相交。共有的下调基因影响细胞增殖、病毒感染和癌变过程中的细胞因子信号传导(图2)。3.c). 0.42 MPa组中20条最富集的KEGG通路如图所示。3.b.最显著富集的KEGG通路是属于“细胞组分”类别的“细胞周期”(图2)。3.b).在0.42 MPa组中，58个上调基因在48 h时构建了排名前10位的KEGG通路网络(图2)。3.d).所有相关基因均上调。最常观察到的四种途径(细胞周期、补体和凝血级联、破骨细胞分化、补体和凝血级联)与细胞增殖和炎症有关(图2)。3.d)。这些数据表明FUS-BBBD (0.42 MPa)可促进与炎症或细胞增殖相关的基因表达增加，从而导致多种相关通路。

FUS-BBBD后的炎症反应与两个参数有关

为了更好地理解FUS-BBBD后的炎症反应，我们分析了与神经炎症相关的GO术语。在0.25 MPa组的氧化石墨烯项中，“炎症反应调节”(GO:0050727)和“炎症反应正调节”(GO:0050729)显著富集(P< 0.05)。4一个;额外的文件1表S3)。在0.42 MPa组中观察到22个氧化石墨烯项(包括0.25 MPa的相同氧化石墨烯项)。4一个;额外的文件1:表S4)。热图分析显示，在0.42 MPa组，与炎症相关的氧化石墨烯相关的deg的表达水平在较晚的时间点显著增加，包括与趋化因子相关的基因(Ccl12，Ccl2，Ccl17，Ccl3，亚兰,Ccr5)、补体系统(C4b和C3ar1，C5ar1和C1qa)、免疫细胞活化(Cd180，Cd68，Icam1,Fcgr1)(图。4b)同时，我们分析了与NF-κB信号通路相关的GO术语。0.25 MPa组“胞质隔离NF-κB”氧化石墨烯项(GO:0007253)富集(图2)。4c;额外的文件1表5)。在0.42 MPa组中，“NF-κB转录因子活性正向调节”(GO:0051092)和“I-κB激酶/NF-κB信号传导”(GO:0007249)的GO项被富集(图2)。4c;额外的文件1表6)。在0.42 MPa组，NF-κB通路相关基因0007253、0051092和0007249的表达在12 h后普遍升高(图2)。4d)。此外，在与炎症反应相关的KEGG类别中，“NF-κB信号通路”(KEGG:04064)显著富集(图2)。4e)。炎症反应或NF-κB通路相关基因的表达水平在0.42 MPa下呈时间依赖性的高度动态变化(图2)。4e).这些DEGs趋势表明，0.42 MPa是一个有毒的FUS参数，可诱导炎症、NF-κB信号传导和免疫细胞浸润。

接下来，我们确定NF-κB信号通路相关蛋白的激活是否与转录组分析结果一致(图2)。4f).在bbbd后6 ~ 24 h, 0.42 MPa组IkBα的磷酸化表达显著增加。此外，被称为i -κ ba下游靶点的phospho-NF-κB p65在较晚的时间点(0.42 MPa)也显著升高(图2)。4f).为了进一步评估RNA测序分析的可靠性，将代表性基因(Ccl12，Bcl2a1b，Ccr5，Stat3，Icam1,C4b)从“炎症反应”热图中选择，并通过实时RT-PCR进行分析(图2)。4g)。Ccl12，Ccr5,和C4b是炎症反应相关的氧化石墨烯术语;Bcl2a1b归属于KEGG04064 (NF-κB信号通路);和Stat3和Icam1分别属于炎症反应和NF-κB家族相关的GO术语。结果表明，deg的表达趋势与实时qRT-PCR结果一致，证实了测序数据的可靠性(图2)。4g).综上所述，0.42 MPa条件通过NF-κB信号传导促进fus - bbbd介导的炎症反应，而0.25 MPa条件对生物反应的影响可以忽略不计。

FUS-BBBD对反应性星形胶质细胞亚型的改变

我们使用免疫荧光(IF)以时间依赖性的方式测定FUS-BBBD后脑组织中胶质细胞的表达模式和形态(附加文件)1:图S6)。正如预期的那样，在Iba-1中观察到显著的激活⁺与假对照组相比，在0.42 MPa下bbbd后1至48 h的细胞(图2)。5a, b)。此外，GFAP的荧光强度⁺在0.42 MPa FUS参数作用48 h后，与假对照组相比，细胞数量明显增加(图2)。5c, d)。在0.25 MPa FUS参数下，胶质细胞(Iba-1⁺和GFAP⁺)在BBBD区无明显改变。这些发现表明，0.42 MPa组反应性胶质细胞的诱导增强，而0.25 MPa组有足够的声压打开血脑屏障而没有神经胶质激活，因此不会诱导炎症。

然后，我们研究了两种FUS条件是否诱导了胶质细胞亚型表达的变化，并发现RNA测序谱在小胶质细胞/星形胶质细胞亚型特异性基因中富集(图2)。6，7)。在0.25 MPa条件下，小胶质细胞相关基因表达未发生改变。此外，虽然在0.42 MPa组中，6 - 48 h内泛小胶质细胞相关基因有所增加，但并不能明显地分化为M1和M2亚型(图2)。6a)此外，我们发现每一类小胶质细胞的三个代表性转录本的qRT-PCR与FPKM值之间存在显著相关性(图2)。6b).转录本的总体表达模式CD40，4英镑,无足的在qRT-PCR和FPKM之间似乎是相似的，而没有显著的相关性。接下来，我们发现，在0.42 MPa组6 - 48 h内，泛活性星形胶质细胞特异性基因表达上调。此外，在0.42 MPa组12 - 48 h内，a2特异性星形胶质细胞基因表达高于a1特异性基因(图2)。7a)反应性星形胶质细胞表型特异性基因的表达模式与RNA测序数据和实时PCR显著相关(图2)。7b).尽管表达模式相似，但转录本的qRT-PCR与FPKM值之间没有显著相关性H2-D1，2英镑和Tm4sf1．在0.42 MPa FUS-BBBD下，a2型星形胶质细胞极化明显，提示大量FUS-BBBD诱导了a2型保护性星形胶质细胞，导致脑损伤。

本研究通过组织病理学和转录组学分析，探讨了在0.25 MPa和0.42 MPa两种不同超声条件下fus诱导血脑屏障通透性的安全性，这两种超声条件诱导的血脑屏障通透性和生物学反应不同。在这项研究中，我们发现在0.25 MPa超声下血脑屏障被成功破坏，没有神经炎症或神经变性。而在0.42 MPa超声作用下，NF-κB信号通路相关分子显著上调，小胶质细胞和星形胶质细胞活化，与以往研究结果相似[13，26，28]．有趣的是，活化的星形胶质细胞主要是A2抗炎表型。这一发现表明，虽然0.42 MPa的FUS条件引起炎症，但它可以通过a2型反应性星形胶质细胞导致脑组织的组织修复。据我们所知，这是首次报道神经胶质细胞在解决炎症事件中的功能作用，这是bbbd后的生物反应。

声压振幅通过影响血管中循环的微泡的振荡来确定血脑屏障的打开效果和组织损伤是重要的[54]．我们应用了两种不同的声压来研究FUS-BBBD的安全性。我们选择0.25 MPa超声条件作为充分的FUS参数来验证血脑屏障后的生物安全性，因为该超声条件在多个研究中被广泛用于小鼠脑内安全破坏血脑屏障[55，56]．在以往的临床前研究中[57，58]，在fus诱导通透性改变后成功递送药物，如阿霉素K_反式范围从0.0086分钟⁻¹至0.0232分钟⁻¹．在本研究中，在0.25 MPa的超声作用下，渗透性能呈现平均值K_反式0.02±0.005分钟⁻¹，这意味着它保证了药物递送的有效性(图2)。1d)。此外，组织学结果显示与对侧区域相比无显著差异，证明了在0.25 MPa声压下fus介导的BBBD安全有效的可行性(图2)。1胃肠道)。根据BBBD的程度，我们采用较高的超声条件(0.42 MPa)来比较差异。与0.25 MPa相比，随着压力幅值的增加，血脑屏障渗透率增加(图2)。1a-d)，但这些观察伴随着可见的微出血、微空泡化和神经退行性变(图2)。1G-i)，与以往的报告一致[54，59]．

通透性和损伤的差异与FUS暴露导致的MB活动类型密切相关[56]．因此，我们通过监测声发射阐明了血脑屏障渗透过程中MB活性与局部损伤之间的相互作用。0.25 MPa声压主要引起稳定的空化(即谐波)，可能导致血脑屏障打开稳定而不可见损伤(图2)。1练习)。另一方面，0.42 MPa在宽带发射中产生谐波和超谐波，表明惯性空化与不良损伤相关(图2)。1练习)。这些结果是一致的，因为通过体内宽带声发射检测到的惯性空化可能是造成损伤的主要因素[60]．此外，我们的研究结果表明，在过度的FUS暴露期间，超谐波发射的显著增加可能导致神经元损伤(图2)。1f,胃肠道)。最近的证据表明，除了惯性空化外，超谐波分量也可以作为损伤预测的相关指标[23]，我们的研究结果支持这一发现。即使使用相同的FUS-BBBD程序，微泡剂量、大小分布和注射方法的差异也会导致血脑屏障通透性和组织损伤的差异。事实上，一些研究已经证明了不同的MB剂量依赖性血脑屏障开放水平和生物效应[32，61]．在本研究中，我们选择了确定剂量的一个条件，以简化实验条件，减少FUS参数应用时MB条件的变化。在FUS-BBBD后引起无菌炎症反应的最佳MB剂量仍然存在争议。Kovacs等人认为，与10 μ l/kg的剂量相比[32> 20 μL/kg的剂量会引起FUS-BBBD后的炎症反应。此外，一些报道表明，FUS-BBBD联合Definity在较高剂量(20-80 μL/kg)下可诱导血脑屏障打开并产生生物学效应。因此，选择20 μL/kg的剂量打开血脑屏障。

一些研究已经引起了对FUS-BBBD炎症反应相关的安全性问题的关注[13，26，28，62]．然而，对这些生物反应的评估仅限于表面变化，如组织学损伤、出血、胶质细胞活化和单一FUS参数时间间隔下的微血管转录组。生物效应对BBBD地区微环境的影响难以全面研究。因此，为了将生物反应与超声声压振幅相关联以确定安全性，我们进行了全基因组转录组分析，以时间依赖性的方式观察FUS治疗BBBD区域大脑分子事件的变化。我们的研究结果显示，在0.25 MPa的超声组织中，基因组表达的变化很少(0.14%)，deg略有下调(图2)。2c)与0.42 MPa超声相比。有趣的是，中枢基因”丛书和EGR1在0.25 MPa暴露诱导BBBD后，KEGG通路富集分析分类的细胞数量减少(图2)。3.c)。”丛书和EGR1据报道，属于立即早期基因(IEG)家族的基因可由脑损伤后的二次侮辱诱导[63，64]．我们还发现，在0.25 MPa超声组织中，直到bbbd后48小时，通过NF-kB信号通路参与炎症的基因和蛋白质都没有显著变化(图2)。4)。虽然这些发现的进一步详细的分子基础仍有待确定，但这些结果表明0.25 MPa条件与急性期炎症反应无关。我们的研究结果表明，FUS- bbbd不同于损伤性血脑屏障功能障碍，尽管最佳FUS参数(0.25 MPa)足以渗透血脑屏障。

另一方面，0.42 MPa超声组织中deg的数量(1.47%)大于0.25 MPa，且呈时间依赖性上调(图2)。2d)。我们发现0.42 MPa上调趋化因子(Ccl12, ccl2, ccl17, ccl3, ccl4，和CCR5)、内皮粘附分子(ICAM1)、互补反应(C4b C3ar1 C5ar1 C1qa)，以及免疫细胞活化基因(Cd180 cd68 fcgr1)， bbbd后6至48小时(图2)。4b)。此外，与0.25 MPa超声条件相比，0.42 MPa超声条件下NF-κB通路相关基因的表达增加(图2)。4d, e)。这些结果与先前的研究一致，表明过量的FUS-BBBD通过NF-κB途径诱导无菌性神经炎症[26，28，62]．一般来说，脑内皮在检测到刺激后立即释放细胞因子和趋化因子来招募和激活血小板和白细胞[65在大脑中引起炎症的物质[66]，以及修复受损组织和血管的基因转录。短暂性急性炎症不仅在神经炎症反应中很重要，而且在再生和神经保护中也很重要[67]．本研究观察到在0.42 MPa时促炎基因表达升高，因此我们需要考虑到，0.42 MPa应激诱导的FUS-BBBD可能会促进保护性免疫反应。

先前的研究表明，小胶质细胞和星形胶质细胞的激活可能有不同的亚型，有有益的，也有有害的，这取决于脑损伤的反应状态或疾病[38，68]．尽管对FUS-BBBD后胶质细胞表型激活的研究越来越多[13，28]，胶质细胞异质性的证据尚未得到很好的确立。据我们所知，这项研究首次利用基因谱分析显示了FUS-BBBD触发的反应性胶质细胞的功能亚型转移[38，69]．我们观察到，在0.25 mpa处理的组织中，胶质细胞的形态和差异基因表达在48小时内没有发生变化(图2)。5，6，7)。根据形态学变化，0.42 MPa FUS-BBBD诱导了bbbd后小胶质细胞(1 - 48小时)和星形胶质细胞(48小时)的明显激活(图2)。5)。在本研究中，尽管泛小胶质细胞标记基因的表达增加，但很难根据遗传谱明确区分M1-/ m2亚型分类(图2)。6)。

与小胶质细胞相比，在0.42 MPa FUS-BBBD条件下，a2型星形胶质细胞比a1型星形胶质细胞更占优势。7)。我们的研究结果表明，0.42 MPa FUS-BBBD可以影响a2型星形胶质细胞极化，促进大脑的恢复和修复。这些结果揭示了一种新的机制，其中反应性神经胶质细胞通过增加a2型星形胶质细胞来产生保护作用，如组织稳态和减轻炎症，尽管会引起神经炎症。

我们的研究有一些局限性;这些发现仅限于FUS-BBBD在健康动物模型中诱导的炎症反应。需要在疾病模型中进一步研究以了解FUS-BBBD后神经胶质细胞极化的病理生理作用。接下来，评估bbbd后48小时的安全性。在0.42 MPa组中，48 h时a1特异性星形胶质细胞基因略有增加。由于反应性胶质细胞的功能亚型转移是暂时的或可逆的，因此了解免疫反应的时间和复杂性对于翻译临床结果很重要[70]．因此，未来的研究应侧重于描述FUS-BBBD对脑组织的长期影响。此外，我们的数据仅包括基因表达和表型变化的信息。为了进一步确定A2型星形胶质细胞在fus介导的破坏后的有效作用，需要更详细的证据来证明反应性A2星形胶质细胞被激活的机制和途径。我们计划在进一步的工作中探讨a2型星形胶质细胞的功能作用。

在这里，我们确定了不同声声压力诱导的BBBD的生物反应。我们的研究结果表明，足够的BBBD条件是安全的，没有血管/组织损伤或脑组织无菌炎症反应。虽然过度超声引起炎症，但它可以通过a2型反应性星形胶质细胞导致组织修复和大脑稳态。

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Gd-DTPA:

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基因本体论

ICD:

惯性空化剂量

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红细胞表面:

红细胞

脉冲重复频率:

脉冲重复频率

rt - pcr:

逆转录聚合酶链反应

镜头分割_h：

具有谐波的稳定空化剂量

镜头分割_u：

超谐波稳定空化剂量

作者感谢K-MEDI中心实验动物中心的动物护理服务

脑研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)支持本研究，由科学，信息通信技术和未来规划部资助[批准号NRF- 2019m3e5d1a02069399和NRF- 2019r1c1c1011615]，韩国健康技术研发项目通过韩国健康产业发展研究所(KHIDI)支持，由大韩民国卫生和福利部和科学和信息通信技术部资助(批准号HU21C0081)。

作者及单位

1. 韩国大邱-庆北医疗革新财团医疗器械开发中心(K-MEDI Hubub)，大邱东区天福路80号，邮编41061

   崔孝珍，韩文，朴陈玉，李恩熙

2. 韩国庆尚南道晋州市晋州大罗501号庆尚南道晋州国立大学计算机科学系，52828

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3. 加川大学未来产业学院，高科技医疗器械系，1342，京畿道城南市水井区城南大罗，13120，韩国

   Juyoung公园

贡献

E-HL、HC和JP构思并设计了本研究;E-HL和HC进行生物学实验，分析数据，撰写稿件;MH用MRgFUS进行BBBD实验;HS用R编程分析RNAseq库;CP进行被动空化检测并分析数据。E-HL和JP编辑修改稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Eun-Hee李或Juyoung公园．

相互竞争的利益

作者声明没有与之竞争的经济利益。

数据可用性

本研究中提供的数据可向通讯作者索取。

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