抑制溶血磷脂酸受体1可通过LPA1/TSP1/CXCR2途径缓解中枢神经系统中PMN的募集，减轻小鼠脑出血后血脑屏障的破坏

背景

自发性脑出血(ICH)的发病率和损害发生率相对较高。由于脑出血引起的后续脑损伤，血脑屏障(BBB)完整性受到损害，这对预后不良至关重要。多形核白细胞(PMN)强烈调节中枢神经系统(CNS)血脑屏障的破坏。溶血磷脂酸受体1 (LPA1)介导星形胶质细胞血小板反应蛋白1 (TSP1)调控，诱导巨噬细胞炎症蛋白2(MIP2)分泌。MIP2通过CXC趋化因子2型(CXCR2)激活增强PMN募集。本研究的目的是探讨lpa1介导的脑出血后PMN募集抑制和血脑屏障保护是否受TSP1和CXCR2网络的调控。

方法

用胶原酶诱导CD1小鼠脑出血。AM966是一种靶向LPA1拮抗剂，在ICH后1和12小时口服。为了进一步确定可能的lpa1介导的血脑屏障保护机制，我们在脑室内(ICV)给药CXCR2配体MIP2，以及用AM966激活TSP1 CRISPR (ACT)。因此，我们进行了神经行为学、脑含水量(BWC)、埃文斯蓝染色(EBS)、免疫荧光(IF)和免疫印迹(WB)分析。

结果

脑出血后，星形胶质细胞表现为LPA1, 24 h后达到峰值，PMN\表现为CXCR2。am966介导的LPA1抑制缓解了PMN的募集，减少了脑水肿，表现出外渗(如EBS所证明的)，保护了血脑屏障的完整性，并增强了脑出血后的神经活动。AM966处理显著降低了ICH后TSP1、CXCR2、Occludin和Claudin-5的表达和PMN的募集，并通过MIP2和TSP1 CRISPR (ACT)恢复了它们的表达。

结论

本研究表明，LAP1抑制可通过TSP1/CXCR2信号传导减少小鼠脑出血后PMN的募集，从而减少血脑屏障的破坏，改善中枢神经系统的神经行为功能。因此，LPA1是脑出血后减少PMN募集和保护血脑屏障完整性的强有力候选药物。

自发性脑出血(ICH)是一种由血液外渗到脑实质引起的中风。它与相对较高的发病率和致残率有关[1]。约有35 ~ 52%的患者在脑出血后30天内死亡，长期预后相对较差[2，3.]。最近的大流行研究表明，脑出血发病率有所增加，现在在年轻人中出现的比例越来越大。然而，很少有有效的治疗方法可以从这种具有挑战性的疾病中恢复过来。4]。ich诱导的继发性脑损伤由神经炎症、血脑屏障(BBB)受损、脑水肿和细胞凋亡引起，是导致患者预后不良的重要因素[5]。血脑屏障是调节脑组织和血液之间物质转移的独特系统，其主要功能是保护中枢神经系统(CNS) [6]。血脑屏障破坏诱导中性粒细胞侵袭，进而加重炎症。同时，神经炎症损害血脑屏障的完整性，从而引起脑水肿[7]。根据一项研究，脑水肿扩大，在脑出血后的第一天最为明显[8]。更多的研究关注于血脑屏障保护以改善ICH后的脑功能[9，10，11]。先前的研究表明，脑脊液和血肿周围区域在脑出血后6小时存在白细胞，白细胞浸润增强脑水肿[beplay靠谱12]。多项研究表明，在多种神经系统疾病中，多形核白细胞(PMN)募集与血脑屏障破坏密切相关[13，14，15，16]。PMN是血脑屏障破坏的主要调节剂，缺乏PMN可恢复血脑屏障的完整性，并最大限度地减少神经炎症期间星形胶质细胞的损失[17]。脑出血后保护血脑屏障的潜在治疗策略是招募PMN。

溶血磷脂酸(LPA)是一种具有生物活性的磷脂，当它在大脑中富集时，通过与其六种受体的相互作用促进多种生物功能[18]。溶血磷脂酸受体1(LPA1)参与许多生物代谢过程，如中枢神经系统内的细胞增殖、存活、凋亡和促炎症[19]。我们之前的研究表明，抑制LPA1可减轻脑出血后的神经炎症，有趣的是，我们还证明抑制LPA1可有效减轻脑水肿和中性粒细胞浸润[12]。然而，目前尚不清楚LPA1抑制是否能保持脑出血后血脑屏障的完整性。Hisaoka-Nakashima和他的团队报道，LPA1激活通过星形胶质细胞中的ERK、MAPK、JNK信号网络刺激血栓反应蛋白-1 (TSP1)的分泌[20.]。TSP1是一种细胞外基质蛋白，它与无数配体(即细胞受体、生长因子、细胞因子和蛋白酶)物理结合，以调节许多生理和病理活动[21，22]。既往研究发现，TSP1诱导小鼠血脑屏障渗漏，从而上调巨噬细胞炎症蛋白2 (MIP-2)等趋化因子的释放[23，24]。此外，CXC趋化因子2 (CXCR2)表达通过释放MIP2促进PMN募集。在脑出血后发现TSP1升高[25]，但目前尚不清楚这对PMN招聘有何影响。此外，脑出血后LPA1是否通过控制TSP1表达影响血脑屏障完整性尚不清楚。本研究假设LPA1抑制可通过减少小鼠脑出血后通过LPA1/TSP1/CXCR2信号通路募集PMN来保护血脑屏障完整性。我们研究了假定的LPA1拮抗剂am966介导的脑屏障破坏衰减和脑出血小鼠神经功能的相关恢复，以进一步了解LPA1受体在脑出血介导的脑屏障破坏中的作用。

老鼠

总共从美国Charles River获得141只8周龄雄性CD1小鼠，体重在30 - 40 g之间，在ICH手术前分开饲养≥3天，开放食物和水。这些老鼠被随机分成实验组。实验设计、分组及每组小鼠见附图S1及补充表S1。所有动物实验都得到了洛马林达大学的伦理批准，并遵循了美国国立卫生研究院的指导方针。此外，我们遵循ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)报告标准。

我建立

如前所述，ICH模型的建立[26]。简单地说，小鼠腹腔注射氯胺酮/噻嗪(100/10 mg/kg)，达到深度麻醉后，将它们面朝下放置在立体定向头架中(Kopf Instruments, Tujunga, CA)。在中线右侧1.5 mm，脑脊膜后0.9 mm处钻一个1mm的颅毛刺切口，在硬脑膜下4mm处将27号针刺入右侧基底节区。胶原酶(0.075 U，用生理盐水0.5µL体积稀释，VII-S;Sigma Aldrich, St. Louis, MO)使用微输液泵(Harvard Instruments, Holliston, MA)以0.25µL/min的速率给药。然而，假手术小鼠被给予0.5µL生理盐水，而不是引起ich的胶原酶。给药完成后，针头再维持10分钟，以尽量减少给药溶液外渗。随后，用骨蜡封住毛刺孔，取下针刺，缝合皮肤，促进小鼠恢复。采用加热毯将小鼠体温保持在37±0.5℃。

试验协议

实验1

在ICH后，我们通过WB分析小鼠右半球在时间点6,12,24和72 h以及7天(n = 6)的LPA1, TSP1和CXCR2表达。为了确定LPA1在星形胶质细胞内的亚细胞定位，我们在ICH后24 h采用免疫荧光(IF)染色(n = 2)。与LPA1一起，我们还染色了胶质原纤维酸性蛋白(GFAP);用CXCR2进行中性粒细胞弹性酶(NE)染色。对照组小鼠进行假手术(SS)。

实验2

采用Ly6G/CD11b IF染色评估Lpa1选择性拮抗剂AM966 (Advanced ChemBlocks, USA, 30 mg/kg) [12]诱导lpa1介导的PMN募集抑制。将小鼠随机分为3组(n = 6)，即SS、ICH + Vehicle (DMSO, ICH + V)和ICH + AM966 (ICH + A)。

实验3

然后，我们评估了AM966抑制LPA1后血脑屏障的完整性。6只小鼠随机分为SS组、ICH + V(DMSO)组和ICH + A组。其中，AM966和载体分别于ich后1和12 h灌胃。脑含水量(BWC)测定于脑缺血后24 h。此外，在ICH后24 h检测CD31/ZO1的Evans Blue染色(EBS)和IF。

实验4

为了进一步研究涉及LPA1/TSP1/CXCR2信号通路的机制，我们使用了MIP2和TSP1 CRISPR激活(ACT)。我们注射了2µl27]的相应crispr (Santa Cruz Biotechnology, USA)在ICH前48 h通过ICV给药注入小鼠。MIP2 (Sigma-Aldrich, USA) 0.01µg [28，29]在ICH后1 h通过ICV给药。小鼠随机分为:SS、ICH + V、ICH + A、ICH + A + PBS、ICH + A + MIP2、ICH + A + CRISPR对照、ICH + A + TSP1 CRISPR。在ICH后24小时进行WB分析。

运动活动评估

改良的Garcia、前肢放置(FP)和转弯检查是盲法进行的，如早期出版物所报道的[30.]。简而言之，改良加西亚测试结合了7种不同的评估，包括自发性、触须接触、侧触、肢体对称、前肢行走、侧向转弯和攀爬活动。我们使用FP测试来量化20次刺激中的左前爪位置。动物被放置在30°竞技场的顶点，并在10次试验中记录左转弯次数。

公约的评估

生物武器含量的测量方法如先前刊物所述[31]。简而言之，在小鼠牺牲后，立即提取脑样本，然后解剖到左/右基底节区、左/右皮层和小脑。使用分析天平(Denver Instrument, USA)称重所有脑解剖部分，以获得相应的湿重(WW)。样品在100℃的烤箱中烘烤24 h后测量干重。生物wc的计算公式为:生物wc (%) = [(WW−DW)/WW] × 100%。

EBS外渗

EBS外渗按先前报道进行[32]。为了制备4%的EBS染料，将EBS粉末(Sigma-Aldrich, USA)重新悬浮在生理盐水中。然后，小鼠腹腔注射(4 mL/kg)，孵育3小时。随后，将小鼠置于深度麻醉下，心脏灌注50 mL冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，并切除大脑并将其分成左右半球，然后将其保存在- 80°C的冰箱中以待进一步分析。每个脑标本加入1100µL PBS，匀浆，超声，离心(4°C, 14000 rcf, 30 min)，得到上清。第二次离心(4°C, 14000 rcf, 30 min)前，加入三氯乙酸(TCA)生成上清。用分光光度计(Thermo Fisher, USA)在610 nm处测定EBS浓度，然后用标准曲线定量。

免疫印迹

western Blot (WB)方案已在前面介绍[33]。简而言之，小鼠在灌注冰冷的PBS之前被麻醉。大脑被切除，接着是两个半球的分离。在4°C下14000 g离心30分钟前，右半球在RIPA裂解缓冲液中均质(Santa Cruz Biotechnology, USA)。从上清中分离的蛋白与上样缓冲液结合，在SDS-PAGE上电泳，转移到硝化纤维素膜上，在阻断缓冲液中阻断2小时，然后在4°C下暴露于补充表中列出的一抗过夜(on)S2。匹配的二抗在室温下孵育1.5 h，然后使用增强型化学发光(ECL) Plus试剂盒(Amersham Biosciences, USA)和成像系统(Bio-Rad, Versa Doc, model 4000)进行蛋白可视化。蛋白定量采用Image J (NIH, USA)。

如果评估

如先前刊物所述，影响因子分析是在[34]。麻醉小鼠用冰冷的PBS灌注，然后切除大脑，10%福尔马林固定，30%福尔马林脱水24小时，用CM3050S低温恒温器(Leica Biosystems，德国)切片至10 μm。接下来将制备好的切片暴露于补充表中总结的一抗中S2在4℃下。接下来，切片在PBS中洗涤，然后在RT下暴露于二抗2小时，随后PBS冲洗和DAPI染色。染色可视化采用荧光显微镜(徕卡显微系统，德国)。

统计分析

使用Graph Pad Prism (San Diego, USA)进行所有统计数据分析。数据以mean±SD表示。多重比较采用单因素方差分析和双向重复测量方差分析，采用Tukey事后检验，p < 0.05为显著性阈值。

小鼠死亡率和淘汰

ICH小鼠的总死亡率为4.4%(5/113)，假手术小鼠的总死亡率为0%(0/28)。当所有的实验小鼠进行比较时，死亡率没有明显的变化。所有模型都没有被淘汰。

颞叶LPA1、TSP1和CXCR2的表达

在脑出血后6、12、24和72 h以及7 d，通过WB分析评估右半球LPA1、TSP1和CXCR2的表达。根据我们的结果，这三种蛋白的表达均增强，并在ICH后24小时达到峰值，相对于假手术小鼠(p < 0.05，图5)。1模拟)。通过双IF染色，我们发现LPA1与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在星形胶质细胞中共定位，CXCR2与中性粒细胞弹性酶(NE)在脑出血后24小时的PMN和假小鼠中共定位(图2)。2）.

AM966处理减少了PMN的募集

使用基于LY6G/ cd11b的IF染色检测红细胞周围区域的PMN募集(图6)。3.A)。根据我们的结果，与ICH后24小时的车辆暴露相比，AM966暴露强烈地减少了PMN的招募(p < 0.05，图2)。3.B)。

AM966抑制LPA1可减少脑出血后血脑屏障的破坏

通过CD31/ZO-1的EBS和IF染色评估血脑屏障的完整性。与灌胃小鼠相比，脑出血后24小时，血肿周围的EBS外渗明显增强(p < 0.05)，给药AM966后，EBS外渗明显减弱(p < 0.05)。4A, B)。在ICH后24小时，血肿周围的CD31和ZO-1重叠强烈减少(p < 0.05)，并在给药AM966后升高(p < 0.05，图2)。4C, D)。

AM966诱导的LPA1抑制减轻了脑出血后的脑水肿，增强了神经功能

在ICH后24和72小时检查生物多样性。与对照小鼠相比，右侧基底节区和皮质BWC分别在24 h和72 h显著增强(p < 0.05)，而在给药AM966后明显减弱(p < 0.05，图2)。4E). AM966在ICH后24和72小时恢复神经行为功能(p < 0.05，图2)。4F-H)。

MIP 2逆转了am966介导的血脑屏障完整性保护

数字5在给药AM966后，TSP1、CXC2R、Occludin和Claudin-5的表达以及PMN的募集明显减少(p < 0.05)，而在给药CXC2R配体MIP2后，这一过程被逆转，在ICH后24 h, CXCR2的表达上调，PMN募集增强，Occludin和Claudin-5的表达减少(p < 0.05，图5)。5f)。

TSP1激活逆转了am966介导的血脑屏障完整性保护

我们使用TSP1 CRISPR激活质粒(TSP1 CRISPR ACT)刺激TSP1的表达来研究其潜在的机制。数字6结果表明，在AM966治疗后，TSP1、CXC2R、Occludin和Claudin-5的表达以及PMN的募集明显减少(p < 0.05)。此外，TSP1 CRISPR (ACT)上调TSP1表达，持续增强CXCR2表达，增强PMN募集，同时降低Occludin和Claudin-5表达(p < 0.05，图5)。6f)。

早期的一项研究表明，抑制LPA1可减轻脑出血啮齿动物的神经炎症和脑水肿。本研究探讨了LPA1抑制是否能减轻小鼠脑出血后血脑屏障的破坏，并阐明了这一现象的机制。根据我们的分析，am966诱导的LPA1抑制强烈减少脑水肿和PMN募集，从而增强脑出血后血肿周围区域血脑屏障的完整性。此外，我们研究了AM966介导血脑屏障保护的机制，发现AM966暴露强烈减少了TSP1的释放，并使下游CXCR2、NE、Occludin和Claudin-5的表达失活。相反，CXCR2配体逆转了am966诱导的效应。同样，通过TSP1 CRISPR (ACT)激活TSP1也会产生相同的影响。这些数据表明，LPA1抑制通过下调ICH后通过TSP1 /CXCR2网络募集的PMN来减弱血脑屏障破坏。

LPA受体在中枢神经系统中普遍存在。其中，LPA1对LPA网络的贡献很大。新出现的报道表明，LPA通过LPA1受体激活诱导皮层星形胶质细胞中TSP1的合成[20.]。TSP1和MIP2在PMN募集中上调[35]， MIP2招募PMN，并激活CXCR2受体。同样，我们还发现出血半球的LPA1含量在ICH后24 h达到峰值。此外，TSP1和CXCR2均随着LPA1的上调而升高。此外，我们的双IF染色显示LPA1与星形胶质细胞共定位，证实了我们早期的发现。同时，我们的研究结果表明，CXCR2与PMN共定位，这一现象在脑出血后明显增强。还有其他关于脑出血通过继发性脑损伤导致血脑屏障中断的报道[36]，而PMN在这一过程中至关重要[37]。在我们之前的研究中，LPA1抑制被用来减少神经炎症和中性粒细胞侵袭，这种方法在使用LPA1选择性拮抗剂AM966的脑出血后显著改善脑水肿和小鼠预后。在此，我们证明AM966强烈下调ICH后PMN的募集和BWC的减少。同样，通过CD31/ZO-1 IF染色和EBS外渗分析，我们发现给药AM966后血脑屏障破坏减轻。我们推测AM966可能会减少PMN的招募，最终改善血脑屏障的完整性。

我们还研究了脑出血后lpa1介导的血脑屏障完整性增强背后的潜在机制。基于新出现的证据，LPA通过激活星形胶质细胞中的LPA1来促进TSP1的释放[20.]。TSP1是特定趋化因子，即JE和MIP-2的调节因子，它们可以通过上调CXCR2受体的表达来增加PMN的募集[23，24，38]。在此，我们证明AM966暴露显著降低了ICH后TSP1和CXCR2的表达以及PMN的募集，同时上调Occludin和Claudin-5的表达。MIP2是一种CXCR2配体，给药显著增强脑组织CXCR2含量和PMN募集，同时逆转AM966的潜在益处。为了证实该网络在血脑屏障保护中的重要性，我们在给药AM966之前使用TSP1 CRISPR (ACT)激活TSP1，并且在给药TSP1 CRISPR (ACT)后，AM966介导的积极作用被逆转。这些证据表明，通过LPA1/TSP1/CXCR2网络抑制LPA1可以保护血脑屏障的完整性。

本研究有一定的局限性。首先，我们只研究了LAP1抑制后PMN招募介导的血脑屏障破坏。脑出血后的血脑屏障破坏病理生理相当复杂，已知LPA1可激活Rho激酶[39，40]，这也与血脑屏障紊乱有关[41]。因此，我们不能排除我们实验中看到的血脑屏障保护不是由活化的Rho激酶引起的。其次，其他科学家和我们团队之前的研究表明，中枢神经系统中普遍存在LPA1含量[42，43]， LPA1可能是细胞死亡的中介，这需要在未来的研究中进一步探索。第三，我们在实验中每组使用6只小鼠，可能会影响结果的力度，但仍然具有统计学意义。为了提高可靠性，我们将增加进一步研究的动物数量。最后，我们采用EBS外渗来评估血脑屏障的完整性。EBS外渗一般只显示大分子量物质(MWSs) [44]。因此，我们没有评估ICH后小MWSs跨血脑屏障转移的可能性。

根据我们的分析，am966介导的LPA1抑制通过LPA1/TSP1/CXCR2网络显著减少PMN的募集，从而增强血脑屏障完整性，减轻脑水肿。鉴于这些证据，LPA1靶向治疗可能是减少脑出血患者PMN招募和保护血脑屏障的有效治疗方法。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据要求从通讯作者处获得。

我:

脑内出血

BBB:

血脑屏障

中枢神经系统:

中枢神经系统

中性粒细胞:

多形核白细胞

摘要:

Lysophosphatidic酸

LPA1:

LPA受体1

常会:

血小板反应蛋白- 1

CXCR2:

CXC趋化因子2型

不适用。

本研究由国家卫生研究院NS081740和ns082184资助John H. Zhang，海南省自然科学基金项目(No.822MS205)，海南省卫生和计划生育产业科研项目(No.21A200327)资助高凌博士，海南省自然科学基金项目(No.821QN1005)资助李鹏博士。海南省临床医学研究中心(No.LCYX202107)资助夏颖博士和海南省临床医学中心。

作者指出

1. 凌高和李鹏对这项工作的贡献相同。

作者及单位

1. 中南大学湘雅医学院海口附属医院神经外科，海南海口570208

   高玲，唐红，夏莹

2. 洛马林达大学医学院生理与药学系，加州洛马林达92354

   高玲，Prativa Sherchan，唐虹，刘宇，肖杰，石辉，罗玉杰，唐吉平，张汉华

3. 洛马林达大学医学中心神经外科与麻醉科，加利福尼亚州洛马林达，92354，美国

   约翰·h·张

4. 中南大学湘雅医学院附属海口医院眼科，海南海口570208

   李鹏

5. 中南大学湘雅第二医院眼科，湖南长沙410000

   李鹏

贡献

LG和JHZ参与了实验设计。LG, LP, HT, HS, YL, JX进行实验，分析数据，并撰写论文。PS, YJL和JPT负责稿件的修改。YX、JPT参与了实验设计、数据分析与解读、稿件编写。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到约翰·h·张或迎夏。

伦理批准和同意参与

所有动物实验均经洛马林达大学机构动物护理和使用委员会批准。该研究遵循了《实验动物护理和使用健康指南》(国家研究委员会)，并遵守了报告体内实验的ARRIVE指南。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

beplay體育施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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